Meningită - Manual De Laborator - Id și Caracterizarea Hib

Versiunea pentru imprimantă Cdc-pdf [19 pagini]

H. influenzae sunt bacili mici, pleomorfe, gram-negative sau coccobacili cu aranjamente aleatorii. H. influenzae este un organism fastidios care crește cel mai bine la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) și necesită hemin (factor X) și nicotinamidă-adenină-dinucleotidă (NAD, cunoscută și sub numele de V factor) pentru creștere. Mediul standard utilizat pentru creșterea H. influenzae este o placă de agar de ciocolată (CAP), care poate fi preparată cu sânge de cal calificat, o sursă bună atât de hemin, cât și de NAD, deși poate fi utilizat și sânge de oaie. Creșterea are loc pe o PAC, deoarece NAD este eliberat din sânge în timpul procesului de încălzire a preparatului de agar de ciocolată (procesul de încălzire inactivează și inhibitorii de creștere), iar heminul este disponibil de la celulele sanguine neemolizate și hemolizate. În mod alternativ, NAD poate fi inclus ca o componentă a suplimentelor lichide de creștere H. influenzae (disponibile comercial sau preparate în laborator), care sunt încorporate în agarul de ciocolată. H. influenzae apar ca colonii mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, incolore pe un CAP (figura 1). Tulpinile încapsulate apar mai mult mucoid decât tulpinile care nu sunt încapsulate, care apar ca colonii gri mai mici și compacte. Nu este evidentă hemoliza sau decolorarea PAC. În timp ce H. influenzae produce un miros înțepător de indol, plăcile nu trebuie deschise pentru a mirosi culturile. H. influenzae nu poate crește pe baza unei BAP nesupuse. Înainte de procedurile de testare de identificare și caracterizare, izolatele ar trebui să fie întotdeauna inspectate pentru puritatea creșterii și o singură colonie ar trebui să fie retrasă, atunci când este necesar, pentru a obține o cultură pură. Pentru următoarele proceduri de identificare și caracterizare, testarea trebuie efectuată la o creștere de 18-24 de ore de la un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) (Figura 2).

Următoarele teste sunt recomandate pentru a confirma identitatea culturilor care morfologic par a fi H. influenzae (Figura 3). H. influenzae poate fi identificat folosind testul Kovac oxidazei și determinând necesitatea heminului și NAD ca cerințe de creștere. Dacă testul oxidazei este pozitiv, trebuie efectuate teste ale heminului și ale factorului de creștere NAD. Dacă testul cerinței factorului de creștere indică faptul că izolatul poate fi H. influenzae, trebuie efectuate teste serologice pentru identificarea serotipului. Această secvență de testare este o modalitate eficientă de a economisi antisera costisitoare și timp. Metodele suplimentare pentru identificarea și caracterizarea H. influenzae folosind instrumente moleculare sunt descrise în Capitolul 10: Metode PCR și Capitolul 12: Metode moleculare.

Practicile nivelului de biosiguranță 2 (BSL-2) sunt necesare pentru lucrări care implică izolații de H. influenzae, deoarece acest organism prezintă un pericol potențial pentru personalul de laborator și mediul de lucru din jur. Vă rugăm să consultați capitolul 4: Securitatea biosecurității pentru a urma recomandările stabilite pentru laboratorii care lucrează în instalațiile BSL-2, deoarece multe dintre testele descrise în acest capitol necesită deschiderea plăcilor cu culturi vii și sunt adesea efectuate în afara unui cabinet de biosiguranță (BSC).

Figura 1. Coloniile H. influenzae pe un CAP

Figura 2. Coloniile H. influenzae pe un CAP

Figura 3. Diagrama de flux pentru identificarea și caracterizarea unui izolat H. influenzae … vezi mai mare

1. Testul oxidazei lui Kovac Testul oxidazei Kovac determină prezența citocromoxidazei. Reactivul oxidazei de Kovac, tetrametil-p-fenilendiamina dihidroclorură, este transformat într-un compus purpuriu de către organismele care conțin citocromul c, ca parte a lanțului lor respirator. Acest test ajută la recunoașterea H. influenzae, dar și alți membri ai genului Haemophilus, precum și specii bacteriene fără legătură, pot, de asemenea, să dea o reacție pozitivă. Tulpinile pozitive și negative ale controlului calității (QC) trebuie testate împreună cu izolatele necunoscute pentru a se asigura că reactivul oxidazei funcționează corect.

   1. Prepararea reactivului oxidazic de 1% din pulberea de oxidază Pentru a preveni deteriorarea prafului de oxidază din stoc, pulberea trebuie depozitată într-un desicator etanș și strâns într-o zonă rece și întunecată. Reactivul oxidazei Kovac este destinat numai pentru diagnostic in vitro. Evitați contactul cu ochii și pielea, deoarece pot provoca iritații. În caz de contact accidental, spălați imediat ochii sau pielea cu apă timp de cel puțin 15 minute.

      1. Se prepară un reactiv de 1, 0% Kovac oxidază dizolvând 0, 1 g de tetrametil-p-fenilendiamină dihidroclorură în 10 ml apă distilată sterilă.

      2. Se amestecă bine și apoi se lasă să stea 15 minute.

         • Soluția trebuie făcută zilnic proaspăt, iar porțiunea neutilizată trebuie aruncată.
         • Alternativ, reactivul poate fi distribuit în 1 ml alicote și păstrat congelat la -20 ° C. Aliquotele trebuie scoase din congelator și dezghețate înainte de utilizare. Aruncați porțiunea neutilizată în fiecare zi când se dezgheță reactivul.

   2. Efectuarea testului oxidazei lui Kovac

      Metoda hârtiei de filtrare

      1. Creste izolatul (ele) care urmează să fie testat timp de 18-24 de ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Pe o suprafață neporoasă (adică farfurie Petri sau farfurie de sticlă), udați o fâșie de hârtie filtrantă cu câteva picături de reactiv oxidaza Kovac.
      3. Lasă banda de hârtie filtrantă să se usuce înainte de utilizare.

      4. Utilizați o buclă de plastic de unică folosință, o buclă de inoculare a platinei sau un stick aplicator din lemn pentru a alege o porțiune dintr-o colonie din creșterea peste noapte pe PAC și frecați-o pe hârtia de filtrare tratată (figura 4).

         Nu folosiți o buclă de nichrom, deoarece poate produce o reacție fals-pozitivă

      5. Respectați hârtia de filtru pentru a schimba culoarea în violet.

      6. Efectuați etapele 3 și 4 cu o tulpină QC pozitivă și negativă pentru a vă asigura că reactivul oxidazei funcționează corect.

         

         Figura 4. Testul oxidazei lui Kovac: reacție negativă și pozitivă pe hârtie de filtru.

      Metoda plăcii

      1. Creste izolatul (ele) care urmează să fie testat timp de 18-24 de ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      2. Eliminați câteva picături din reactivul oxidazei Kovac direct pe deasupra câtorva colonii suspecte care cresc în perioada 18-24 ore CAP.

         Nu inundați întreaga placă, deoarece bacteriile expuse reactivului nu sunt de obicei viabile pentru subcultură

      3. Înclinați placa și observați coloniile pentru o schimbare de culoare spre violet.
      4. Efectuați etapele 1 și 2 cu o tulpină QC pozitivă și negativă pentru a vă asigura că reactivul oxidazei funcționează corect.

   3. Citirea rezultatelor testului oxidazei

      • Reacțiile pozitive se vor dezvolta în decurs de 10 secunde sub forma unei culori purpurii în care bacteriile au fost aplicate pe hârtia de filtrare tratată. Reacțiile întârziate sunt puțin probabile cu H. influenzae.
      • Reacțiile negative nu vor produce o schimbare de culoare pe hârtia de filtrare tratată.

2. Identificarea heminului și NAD ca cerințe de creștere H. influenzae este un organism fastidios și poate fi identificată pe baza cerințelor de creștere pentru hemin și NAD. H. influenzae poate fi diferențiat de majoritatea altor specii de Haemophilus prin cerința sa specifică atât pentru hemin, cât și pentru NAD pentru creștere (Tabelul 1). H. haemolyticus este singura altă specie care necesită atât hemin, cât și NAD pentru creștere; cu toate acestea, această specie diferă de H. influenzae prin producerea de beta-hemoliză (limpede) pe sângele de cal sau iepure. Pentru pacienții cu meningită bacteriană, H. influenzae trebuie considerat a fi agentul cauzal prezumtiv, spre deosebire de H. haemolyticus, atunci când sunt necesari atât factori heminici cât și NAD pentru creștere. Pentru a face diferența între cele două specii, hemoliza trebuie verificată pe agarul de sânge de cal sau iepure (a se vedea secțiunea II. B., secțiunea de placă Quad Quad de la Haemophilus ID de mai jos). H. haemolyticus provoacă de obicei hemoliză pe aceste medii, în timp ce H. influenzae nu. S-a raportat recent că H. haemolyticus are tendința de a-și pierde rapid proprietatea hemolitică atunci când este trecut in vitro (2). Acest lucru a făcut identificarea definitivă a H. influenzae și H. haemolyticus folosind doar teste biochimice foarte dificile și alte metode, precum testarea moleculară, pot fi folosite pentru diferențierea dintre cele două specii.

   Tabelul 1. Identificarea Haemophilus spp. prin necesitățile lor de creștere pentru hemin (factor X) și NAD (factor V) și β-hemoliză pe agar de sânge de cal

   Tabelul 1. Identificarea Haemophilus spp. prin necesitățile lor de creștere pentru hemin (factor X) și NAD (factor V) și β-hemoliză pe agar de sânge de cal

   Organism	Cerință pentru hemin (factor X)	Cerință pentru NAD (factor V)	β-hemoliză pe agar de sânge de cal
   H. influenzae	+	+	-
   H. parainfluenzae 1	-	+	-
   H. hemolitic	+	+	+
   H. parahaemolyticus	-	+	+
   H. aphrophilus 2	+	-	-
   H. paraphrophilus 1, 2	-	+	-

   Afișați mai multe

   Note de subsol

   ¹ H. parainfluenzae este ornitină decarboxilază pozitivă, în timp ce H. paraphrophilus este negativ.

   ² Deși cerințele lor pentru hemin și factorul NAD diferă între ele, H. aphrophilus și H. paraphrophilus au fost recent reclasificate ca o singură specie cu un nou gen: Aggregatibacter aphrophilus (3).

   1. Efectuarea testului de cerință a factorului de creștere hemin și NAD folosind discuri de hârtie și / sau benzi Cerințele factorului de creștere pot fi identificate cu discuri de hârtie și / sau benzi folosind principiile difuziei de agar.

      Procedura de cerință a factorului de creștere folosind discuri de hârtie și / sau benzi

      1. Creste izolata (ele) care urmează să fie testată timp de 18-24 de ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      2. Pregătiți o suspensie moderat de grea a celulelor (comparabilă cu un standard de 1, 0 McFarland) de la creșterea peste noapte pe PAC într-un bulion adecvat (soia tripticazei, infuzie cardiacă sau apă peptonică) și amestecați bine folosind un vortex.

         Nu transferați niciunul dintre mediile de agar de ciocolată de pe placă în suspensia celulară, deoarece chiar și cea mai mică cantitate de agar va afecta testul și poate duce la identificarea greșită a bacteriilor

      3. Inoculați o jumătate dintr-o infuzie cardiacă sau o placă de agar de soia tripticazei cu 10 ul de suspensie celulară folosind o buclă sau un tampon steril și lăsați suspensia să se usuce.

         Pe aceeași placă pot fi testate două izolate diferite, dar trebuie să aveți grijă ca culturile să nu se suprapună

      4. Puneți discuri de hârtie sau benzi care conțin hemin, NAD și hemin / NAD pe placa inoculată după ce inoculul s-a uscat.

         Atunci când două tulpini bacteriene sunt testate pe aceeași placă (Figura 5), discurile trebuie să fie plasate în modul exact arătat, păstrând discurile hemin individuale și NAD separate de cel care conține ambii factori și lăsând cât mai mult spațiu între discuri.

      5. Efectuați pașii 1-4 folosind un H. influenzae și un alt Haemophilus spp. QC tulpina pentru a vă asigura că discurile sau benzile hemin și NAD funcționează corect.
      6. Invertiți cu atenție placa și incubați timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      7. Observați creșterea în jurul discurilor sau benzilor de hârtie.

      

      Figura 5. Identificarea heminului (factor X) și NAD (factor V) ca cerințe de creștere folosind discuri de hârtie. Tulpina de sus crește doar în jurul discului care conține atât hemin, cât și NAD (săgeată neagră) și este, probabil, identificat ca H. influenzae.

      Citirea rezultatelor discului și / sau discului de hârtie hemin și NAD

      • H. influenzae va crește numai în jurul discului de hârtie care conține atât hemin, cât și NAD, așa cum se arată în figura 5 din jumătatea superioară a plăcii (vezi săgeata neagră).

        H. haemolyticus va crește doar în jurul discului de hârtie care conține atât hemin, cât și NAD. Pentru a face diferența între cele două specii, hemoliza trebuie verificată pe agar de sânge de cal sau iepure inoculând suspensia celulară menționată mai sus pe agar de infuzie cardiacă cu sânge de iepure 5% (sau baza de perfuzie de agar conținând sânge de cal). În mod alternativ, poate fi utilizată o placă Haemophilus ID Quad (vezi Secțiunea II. B. de mai jos)

      • Alte Haemophilus spp. va crește în jurul discului care conține atât hemin, cât și NAD și fie heminul individual, fie discul NAD.
      • Alternativ, se poate utiliza testul cu porfirină (2). Aceasta determină necesarul de hemin al izolatului evitând totodată problema transferului de hemin din mediile de cultură primară și contaminarea cu hemin a mediilor de testare (3).
   2. Efectuarea testului de cerință al factorului de creștere hemin și NAD folosind plăci Ha Quad Quad ID Haemophilus Placile Quad Quad Haemophilus sunt o altă metodă pentru determinarea cerințelor de creștere a izolatelor Haemophilus (Figura 6). Deși sunt mai scumpe decât discurile sau benzile de hârtie, ele pot testa β-hemoliza (limpede) pe sângele de cal și pot ajuta la diferențierea H. haemolyticus de H. influenzae. Placa Quad este împărțită în patru compartimente. Un cadran include un mediu care conține doar hemin (Figura 6, stânga jos). Al doilea cadran include un mediu care conține doar NAD (Figura 6, stânga sus). Al treilea cadran conține mediu care include atât heminul, cât și NAD (Figura 6, dreapta sus). Al patrulea cadran conține o bază de agar pentru infuzie cardiacă sau o bază de agar de sânge cu 5% sânge de cal (Figura 6, dreapta jos) pentru detectarea hemolizei și diferențierea H. haemolyticus de H. influenzae. Procedura de cerință a factorului de creștere folosind plăci Ha Quad Quad ID Haemophilus
      1. Creste izolatul (ele) care urmează să fie testat timp de 18-24 de ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Pregătiți o suspensie de celule (comparabilă cu un standard 0, 5 McFarland) de la creșterea peste noapte a Haemophilus suspectat pe un CAP într-un bulion de soia tripticază sau apă distilată și amestecați bine folosind un vortex.

      3. Utilizați o buclă sterilă de inoculare pentru a strecura o buclă de suspensie celulară pe un cadran al plăcii Quad. Strecurați întregul cadran, începând de la periferia plăcii și strecurand spre centrul plăcii.

         • Utilizați o buclă de inoculare diferită pentru a strecura fiecare dintre ceilalți cadranți cu suspensia celulară.
         • Înjunghiați în agarul de sânge pentru detectarea β-hemolizei (limpede).
      4. Se incubează timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      5. După incubare, examinați cadranii individuali pentru creștere și cadranul cu sânge de cal pentru hemoliză unde placa a fost înjunghiată cu bucla (figura 6).

      Citiți rezultatele plăcii Haemophilus ID Quad

      • H. influenzae va crește doar pe cadranul care conține atât hemin, cât și NAD și cadranul care conține sânge de cal. Nu va hemoliza celulele sanguine ale calului.

        H. haemolyticus își poate pierde proprietatea hemolitică atunci când este trecut in vitro. Acest lucru a făcut identificarea definitivă a H. influenzae și H. haemolyticus folosind doar teste biochimice foarte dificile și alte metode, precum testarea moleculară, pot fi folosite pentru diferențierea dintre cele două specii

      • Un organism care crește fie pe hemin, fie pe cadranul NAD este probabil o altă specie Haemophilus
      • Dacă creșterea pe fiecare cadran, izolația nu este probabil Haemophilus spp.

      • H. influenzae poate să arate ocazional o creștere ușoară în cadranul care conține doar NAD.

        

        Figura 6. Schema de creștere pentru H. influenzae pe o placă Haemophilus ID Quad

      Controlul calității plăcilor Quad

      QC trebuie efectuat pe fiecare lot nou de plăci Quad înainte de a fi utilizate pentru izolate necunoscute pentru a se asigura că vor susține creșterea corespunzătoare a Haemophilus spp. Trei plăci din fiecare lot nou primit trebuie testate folosind o tulpină de referință bine caracterizată de H. influenzae, H. haemolyticus și H. parahaemolyticus. De asemenea, trebuie testată o placă neinoculată din fiecare lot nou pentru a verifica contaminarea mucegaiului sau a altor organisme în laborator și / sau incubator. QC trebuie repetat pe plăci dintr-o mulțime dacă au fost expuse la temperaturi peste 4 ° C sau dacă există motive să suspectăm că plăcile au fost contaminate de la efectuarea controlului inițial.

      Procedura pentru controlul calității plăcilor Quad

      1. Examinați plăcile Quad dacă există dovezi de contaminare microbiană, decolorare, uscare, deteriorare sau alte defecte fizice care pot interfera cu utilizarea. Rețineți fermitatea agarului în timpul procedurii de inoculare.
      2. Creșteți tulpinile de referință care urmează să fie testate timp de 18-24 ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      3. Inoculați plăcile Quad folosind suspensii de celule din tulpinile de referință, așa cum este descris în procedura cu placă Quad de mai sus.
      4. Incubați plăcile timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      5. Ca un control negativ pentru contaminare, incubați o placă neinoculată din fiecare lot nou timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      6. Examinați plăcile inoculate și neinoculate după 18-24 ore pentru creșterea corectă a Haemophilus spp.

      Citirea rezultatelor testelor de control de calitate

      • H. influenzae va crește doar pe cadranul care conține atât hemin, cât și NAD și cadranul care conține sânge de cal. Nu va hemoliza celulele sanguine ale calului.
      • H. haemolyticus va crește doar pe cadranul care conține atât hemin, cât și NAD și cadranul care conține sânge de cal. Va hemoliza celulele sanguine ale calului.
      • H. parahaemolyticus va crește pe toți cadranii, cu excepția celui care conține doar hemin. Va hemoliza celulele sanguine ale calului.
      • H. parahaemolyticus va crește pe toți cadranii, cu excepția celui care conține doar hemin. Va hemoliza celulele sanguine ale calului.
      • Rezultat eșuat: nicio creștere sau creștere slabă a tulpinii de referință pe mediile adecvate și / sau creșterea organismelor pe mediile neinoculate.

3. Identificarea serotipului H. influenzae Haemophilus influenzae poate fi încapsulat cu unul dintre șase tipuri de capsule distincte antigenic, care pot fi serotipate folosind antiserice pentru fiecare capsulă (serotipuri af). H. influenzae poate fi, de asemenea, neîncapsulat și astfel de tulpini care nu pot fi serotipate se numesc H. influenzae nontypeable (NT). Antisera individuală specifică serotipurilor pentru aceste serotipuri majore este disponibilă comercial. Un antiserum polivalent care recunoaște toate cele 6 serotipuri este de asemenea disponibil comercial. Nu este întotdeauna practic să se testeze toate serotipurile pentru care sunt disponibile antiserici într-un laborator. Algoritmii de testare pot fi stabiliți în laboratoare cu cunoștințe anterioare despre faptul dacă un program de vaccinare cu virusul anti-serotip b (Hib) a fost implementat sau nu în cadrul acelei regiuni geografice. Modificările aduse algoritmului de testare pentru orice laborator bazat pe informații privind starea de vaccinare Hib din regiune.

   Este esențial ca laboratoarele de referință să aibă capacitatea de a izola, identifica și caracteriza serotipul izolatelor de H. influenzae. Aceste date valoroase oferă laboratoarelor și autorităților de sănătate publică instrumentele pentru identificarea focarelor controlabile prin campaniile de vaccinare și recunoașterea serotipurilor care provoacă boala sporadică.

   Algoritmul de testare SAST pentru zonele fără un program de vaccinare Hib stabilit

   Dacă nu s-a pus în aplicare un program de vaccinare Hib în țara sau regiunea din care a izolat izolat, este posibil ca izolatul H. influenzae să fie serotip b și izolatul să fie testat mai întâi pentru reactivitatea la antisera serotipului B și un control salin negativ. Dacă izolatul reacționează pozitiv cu antiserumul serotip b fără aglutinare în soluție salină, izolatul este identificat ca Hib. Cu toate acestea, dacă izolatul nu este reactiv cu antiserumul serotip b și dacă este disponibil antiserum polivalent, acesta trebuie testat cu antiserum polivalent. Dacă este pozitiv, izolatul trebuie testat cu antisera monovalentă rămasă (a, c, d, e și f) pentru a determina serotipul. Dacă este negativ pentru toate antiserurile monovalente și pozitiv pentru cerințele de creștere a heminului și NAD, atunci izolatul este considerat NT.

   Algoritmul de testare SAST pentru zonele cu program de vaccinare Hib stabilit

   Dacă izolatul provine dintr-o țară sau regiune cu un program de vaccinare Hib stabilit, care are acoperire mare a vaccinului Hib, izolatul este probabil să fie NT sau un alt serotip decât b. În acest caz, izolatul trebuie testat mai întâi cu antiserum polivalent, dacă este disponibil, și un control salin negativ. Dacă este pozitiv pentru antiserumul polivalent fără aglutinare în soluție salină, izolatul trebuie testat cu antisera monovalentă rămasă (a, b, c, d, e și f) pentru a determina serotipul. Dacă izolatul este negativ pentru antiserumul polivalent și / sau antisera monovalentă și necesită creșterea heminului și NAD, atunci izolatul este considerat NT.

   1. Testul de serotipare cu aglutinație diapozitivă (SAST) pentru izolarea serotipării H. influenzae Suspensiile ucise de hormonală de H. influenzae trebuie utilizate pentru testarea SAST în loc de suspensiile saline ale organismelor vii pentru a menține un mediu de lucru sigur. O soluție de 5% soluție salină fiziologică formalinizată este suficientă pentru a omorî bacteriile. Cu toate acestea, formalina este un cancerigen și trebuie păstrată și manipulată cu mare atenție. În mod alternativ, munca trebuie efectuată sub capota biosecurității dacă nu este utilizată formalina. Antisera trebuie păstrată la frigider la 4 ° C și încălzită la temperatura camerei (25 ° C) înainte de utilizare. Trebuie să fie pus din nou în frigider imediat ce se termină testarea pentru a preveni pierderea activității de legare a anticorpului.

   2. Efectuarea testului SAST

      1. Creste izolata (ele) care urmează să fie testată timp de 18-24 de ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Curățați o lamă de sticlă cu alcool (opțional dacă lamelele sunt curățate în prealabil).

      3. Împărțiți diapozitivul în secțiuni egale (de exemplu, douăsprezece secțiuni de 11 X 22 mm pe un tobogan standard de 50 X 75 mm) cu un stilou impermeabil lichid sau un creion de ceară.

         Fiecare izolat va avea nevoie de tot atâtea secțiuni pe antisera care vor fi testate (polivalente și / sau specifice serotipului individual), precum și un control negativ salin

      4. În porțiunea inferioară a fiecăreia dintre secțiunile diapozitivei de sticlă descrise în etapa (2), se adaugă 10 ul de soluție salină formalizată 5% cu un micropipetor.

         • Instrucțiunile specifică utilizarea unui micropipetor cu vârfuri filtrate sterilizate pentru a măsura 10 pl de soluție salină formalinizată de 5% pentru a suspenda bacteriile. Micropipetorul va transfera măsurători precise și egale pentru o reacție SAST corectă.
         • Dacă un micropipetor și vârfuri nu sunt disponibile, bucle de inoculare sterile, de unică folosință, de unică folosință pot fi utilizate pentru a transfera 10 pl de soluție salină formalinizată cu 5%, dar deseori nu furnizează cantități exacte (între 5-10 pl).
      5. Utilizați o buclă de inoculare sterilă de unică folosință de 10 ul pentru a colecta câteva colonii de la suprafața culturii peste noapte incubate pe PAC.

      6. Suspendează bacteriile din soluția salină formalinizată cu 5% din porțiunea inferioară a fiecărei secțiuni a lamelei. Suspensia trebuie să fie moderat opacă (a se vedea controlul salin din figura 7). Nu lăsați suspensia celulară să se usuce înainte de a adăuga antisera.

         Dacă bacteriile sunt greu de suspendat direct pe diapozitiv, faceți o suspensie moderată lași (comparabilă cu standardul McFarland 6.0) a culturii de testare într-un flacon mic, cu 250 ul de 5% soluție salină formalinizată și scurt vortex suspensia pentru a se amesteca și rupe orice peleti. Adăugați 10 ui din această suspensie în porțiunea inferioară a lamelei

      7. În porțiunea superioară a fiecărei secțiuni a lamelelor de sticlă descrise la etapa (2), se adaugă 10 ul de antiserici polivalenți și / sau specifici serotipului care urmează să fie testate, precum și soluție salină neformalinizată sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) pentru o control negativ cu un micropipetor.

         • NU folosiți picuratorul furnizat cu antisera, deoarece de obicei oferă cantități mai mari decât este necesar și poate fi contaminat cu ușurință.
         • Dacă un micropipetor și vârfuri nu sunt disponibile, bucle de inoculare sterile, de unică folosință, de unică folosință pot fi utilizate pentru a transfera 10 pl de antiseră, dar adesea nu furnizează cantități exacte (între 5-10 pl).
         • Eliminați vârful sau bucla folosită pentru a transfera antisera pe diapozitiv într-un recipient de deșeuri după fiecare utilizare, pentru a evita contaminarea antiserului. Dacă sursa de antiserici este contaminată, trebuie utilizat un flacon nou.
      8. Înclinați ușor diapozitivul pentru a amesteca suspensiile celulare cu antisera din fiecare secțiune. Continuați să balansați ușor diapozitivul timp de 1 până la 2 minute pentru a permite porțiunile inferioare și superioare să se amestece complet. Nu folosiți o mișcare circulară în timp ce balansează, deoarece poate provoca secțiunile cu diferite antiseruri specifice serogrupului să se alăture și să se contamineze reciproc.
      9. După 2 minute, examinați reacțiile SAST sub o lumină strălucitoare și pe un fundal negru. Utilizați sistemul de evaluare din figura 7 pentru a determina intensitatea reacției de aglutinare în fiecare secțiune a lamelei. Nu luați în considerare orice aglutinare care apare după perioada de 2 minute.
      10. Înregistrați rezultatele SAST în jurnalul de laborator.

   3. Citirea rezultatelor SAST

      Evaluarea intensității reacției de aglutinare

      Aglutinarea apare atunci când antisera se leagă de celulele bacteriene, determinând aglutinarea sau aglomerarea celulelor, făcând astfel suspensia celulară să pară mai clară. Intensitatea reacției de aglutinare poate varia în funcție de densitatea suspensiei celulare sau a antiserului utilizat. O descriere a gradelor de intensitate prezentate în figura 7 este prezentată mai jos.

      4+ Toate celulele se aglutinează și suspensia celulară este limpede

      3+ 75% din celule se aglutinează și suspensia celulară rămâne ușor tulbure

      2+ 50% din celule se aglutinează și suspensia celulară rămâne ușor tulbure

      1+ 25% din celule se aglutinează și suspensia celulară rămâne ușor tulbure

      +/- Mai puțin de 25% din celule se aglutină și apare o materie granulară fină

      0 Fără aglutinare vizibilă; suspensia rămâne tulbure și netedă

      

      Figura 7. Evaluarea intensității reacției de aglutinare

      Determinarea serotipului

      • Un rezultat pozitiv este desemnat de un 3+ sau 4+ (aglutinare puternică) în 1-2 minute.
      • Un rezultat negativ este desemnat de 0 (soluție salină), +/-, 1+ sau 2+ (slabă aglutinare).
      • Serotipul este determinat atunci când apare un rezultat pozitiv cu antiserumul polivalent și / sau doar cu unul dintre antiserurile specifice serotipului și nu cu soluția salină.

      • Dacă un serotip nu este determinat, izolatul este considerat NT. Următoarele combinații de rezultate sunt raportate ca NT:

        • Aglutinarea în soluție salină, indiferent de reacțiile puternice cu antisera polivalentă sau cu alte antiseruri specifice serotipului, caracterizează cultura ca autoaglutinant.
        • Aglutinarea cu polivalentă și / sau mai multe antiseruri specifice serotipului în absența aglutinării în soluție salină caracterizează cultura drept polaglutinant sau reactiv încrucișat.
        • Nici o aglutinare cu polivalentul sau cu oricare dintre antiserale specifice serotipului sau cu soluția salină nu caracterizează tulpina drept neactivă.
        • Deși rară, un izolat pozitiv pentru antiserumul polivalent, dar negativ pentru antisera specifică serotipului este considerat NT.

   4. Depanarea procedurii SAST Izolatele H. influenzae sunt supuse unei variabilități (încapsulate vs. neîncapsulate, mici sau mari colonii, cultivatori lente față de cultivatori repezi și aglutinatori grei vs. aglutinatori ușori) și pot fi neclari sau dificil de interpretat. Câteva proceduri de depanare sunt enumerate mai jos:

      1. Repetați testul direct pe lamă folosind creșterea dintr-o altă secțiune a aceleiași plăci.
      2. Faceți o suspensie de celule într-un tub mic și vortex dacă rezultatul de la SAST direct pe lamelă nu este clar și repetați testul.
      3. Adăugați 20 ui de antiserici direct pe lamă și apoi adăugați o buclă de organism fără a dilua epruveta cu 5% soluție salină formalinizată.
      4. Subcultura și reluarea creșterii proaspete a doua zi.

      5. Dacă placa originală conține colonii de dimensiuni diferite, faceți o subcultură pentru fiecare tip de colonie și testați ambele culturi a doua zi. Coloniile mai mari indică de obicei o mai bună producție de capsule și, prin urmare, o reactivitate mai bună. Cu toate acestea, coloniile mai mici vor da ocazional un rezultat mai bun.

         Dacă discrepanțele nu sunt rezolvate imediat, orice repetări ulterioare SAST trebuie utilizate împreună cu tulpinile de control

   5. Controlul calității antiserarelor pentru testarea SAST Un set de tulpini de referință pentru serotipurile H. influenzae a, b, c, d, e și f (unul pe serotip) și o tulpină de H. influenzae incontestabilă ar trebui să fie utilizate pentru a controla antisera înainte de a testa orice izolate necunoscute. QC al antisera ar trebui să fie:

      • Realizat pentru fiecare lot nou de antiseruri recepționate în laborator.
      • Se efectuează bianual după testarea inițială a QC.
      • Se repetă dacă un flacon a fost expus la temperaturi peste 4 ° C sau dacă există motive să se suspecteze că flaconul a fost contaminat de la efectuarea controlului inițial.

      Urmați procedura de testare SAST pentru a verifica fiecare lot de antiserici utilizând toate tulpinile de referință disponibile în laborator. Înregistrați rezultatele furnizate pe foaia de exemplu QC din figura 8.

      Citirea rezultatelor testelor de control de calitate

      Test de trecere:

      • Antiserumul trebuie să administreze 3+ sau 4+ aglutinare cu antigene omoloage în 1-2 minute.
      • Antiserumul nu trebuie să reacționeze cu serotipurile heterologe H. influenzae, cu tulpina de referință NT sau cu soluție salină.

      Proba eșuată:

      • Antiserumul se aglutinează cu una sau mai multe tulpini de referință și / sau cu tulpina de referință NT și / sau în soluție salină.

        Figura 8. Exemplu de fișă QC pentru testarea antiserarelor împotriva tuturor serotipurilor H. influenzae

        	A (număr de tulpină)	B (număr de tulpină)	C (număr de tulpină)	D (număr de tulpină)	E (număr de tulpină)	F (număr de tulpină)	NT (număr de tulpină)
        A Mult#	++	-	-	-	-	-	-
        B Mult#	-	++	-	-	-	-	-
        C Mult#	-	-	++	-	-	-	-
        D Lot #	-	-	-	++	-	-	-
        E Mult#	-	-	-	-	++	-	-
        F Mult#	-	-	-	-	-	++	-
        Poli Mult#	++	++	++	++	++	++	-
        salin	-	-	-	-	-	-	-

        Afișați mai multe

        Figura 8. Exemplu de fișă QC pentru testarea antiserarelor împotriva tuturor serotipurilor H. influenzae

4. Truse de identificare comercială Sunt disponibile mai multe sisteme de identificare comercială care utilizează substraturi biochimice sau enzimatice pentru identificarea Haemophilus spp. Aceste sisteme pot necesita ocazional teste suplimentare și trebuie luate în considerare caracteristici suplimentare, cum ar fi morfologia microscopică și colonială. În general, fiecare sistem este de sine stătător, dar poate fi necesară adăugarea unuia sau mai multor reactivi pentru a completa anumite reacții. Instrucțiunile producătorului trebuie respectate cu exactitate atunci când utilizați aceste truse. Unele dintre kiturile de identificare comercială includ, de asemenea, biotipizarea H. influenzae. Pentru instrucțiuni detaliate și utilizarea tulpinilor de control adecvate, consultați Manualul de proceduri de microbiologie clinică (1).

Referințe

1. Manual de proceduri de microbiologie clinică, ediția a III-a. 2010. ASM. Washington, DC 2.540 de pagini.
2. Murray, PR, EJ Baron, JH Jorgensen, ML Landry și MA Pfaller (ed.). Manual of Microbiology Clinical, 9th ed, vol. 2007. ASM Press, Washington, DC
3. Norskov-Lauritsen, N., și M. Kilian. Reclasificarea actinobacillus actinomycetemcomitans, Haemophilus aphrophilus, Haemophilus paraphrophilus și Haemophilus segnis ca Aggregatibacter actinomycetemcomitans gen. nov., pieptene. nov., pieptene Aggregatibacter aphrophilus. noi și pieptene Aggregatibacter segnis. nov. și descrierea emisă a Aggregatibacter aphrophilus pentru a include izolatele NAD dependente de factor și NAD izolate independent de factor. 2006. Revista internațională de microbiologie sistematică și evolutivă. 56: 2135-2146.

Începutul paginii