Meningită - Manual De Laborator - Id și Caracterizarea Neisseria

Versiunea pentru imprimantă Cdc-pdf [15 pagini]

N. meningitidis sunt diplococi gram-negative, în formă de boabe de cafea, care pot apărea intracelular sau extracelular în leucocitele PMN. N. meningitidis este un organism fastidios, care crește cel mai bine la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări). Poate crește atât pe o placă de agar de sânge (BAP), cât și pe o placă de agar de ciocolată (CAP). Coloniile de N. meningitidis sunt cenușii și nepigmentate pe un BAP și apar rotunde, netede, umede, strălucitoare și convexe, cu o margine clar definită. N. meningitidis apar ca colonii mari, incolore, până la gri, opace, pe un CAP. Înainte de procedurile de testare de identificare și caracterizare, izolatele ar trebui să fie întotdeauna inspectate pentru puritatea creșterii și o singură colonie ar trebui să fie retrasă, atunci când este necesar, pentru a obține o cultură pură. Pentru următoarele proceduri de identificare și caracterizare, testarea trebuie să fie efectuată la o creștere de 18-24 de ore de la un BAP (Figura 1) sau un CAP (Figura 2) la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-o lumânare - borcan).

Testele următoare sunt recomandate pentru a confirma identitatea culturilor care morfologic par a fi N. meningitidis (Figura 3). N. meningitidis poate fi identificat folosind testul Kovac oxidazei și utilizarea carbohidraților. Dacă testul oxidazei este pozitiv, trebuie efectuată testarea utilizării carbohidraților. Dacă testul de utilizare a carbohidraților indică faptul că izolatul poate fi N. meningitidis, trebuie efectuate teste serologice pentru identificarea serogrupului. Această secvență de testare este o modalitate eficientă de a economisi antisera costisitoare și timp. Metodele suplimentare pentru identificarea și caracterizarea N. meningitidis folosind instrumente moleculare sunt descrise în Capitolul 10: Metode PCR și Capitolul 12: Metode moleculare.

Practici de nivel biosiguranță 2 (BSL-2) sunt necesare pentru lucrări care implică izolații de N. meningitidis, deoarece acest organism prezintă un pericol potențial pentru personalul de laborator și mediul de lucru din jur. Vă rugăm să consultați capitolul 4: Securitatea biosecurității pentru a urma recomandările stabilite pentru laboratorii care lucrează în instalațiile BSL-2, deoarece multe dintre testele descrise în acest capitol necesită deschiderea plăcilor cu culturi vii și sunt adesea efectuate în afara unui cabinet de biosiguranță (BSC). instrumentele moleculare sunt descrise în Capitolul 10: Metode PCR și Capitolul 12: Metode moleculare.

Figura 1. Coloniile N. meningitidis pe un BAP

Figura 2. Coloniile N. meningitidis pe un CAP

Figura 3. Diagrama de flux pentru identificarea și caracterizarea unui izolat de N. meningitidi

1. Testul oxidazei lui Kovac Testul oxidazei Kovac determină prezența citocromoxidazei. Reactivul oxidazei de Kovac, tetrametil-p-fenilendiamina dihidroclorură, este transformat într-un compus purpuriu de către organismele care conțin citocromul c, ca parte a lanțului lor respirator. Acest test ajută la recunoașterea N. meningitidis, dar și alți membri ai genului Neisseria, precum și specii bacteriene fără legătură, pot, de asemenea, să dea o reacție pozitivă. Tulpinile pozitive și negative ale controlului calității (QC) trebuie testate împreună cu izolatele necunoscute pentru a se asigura că reactivul oxidazei funcționează corect.

   1. Prepararea reactivului oxidazic de 1% din pulberea de oxidază Pentru a preveni deteriorarea prafului de oxidază din stoc, pulberea trebuie depozitată într-un desicator etanș și strâns într-o zonă rece și întunecată. Reactivul oxidazei Kovac este destinat numai pentru diagnostic in vitro. Evitați contactul cu ochii și pielea, deoarece pot provoca iritații. În caz de contact accidental, spălați imediat ochii sau pielea cu apă timp de cel puțin 15 minute.

      1. Se prepară un reactiv de 1, 0% Kovac oxidază dizolvând 0, 1 g de tetrametil-p-fenilendiamină dihidroclorură în 10 ml apă distilată sterilă.

      2. Se amestecă bine și apoi se lasă să stea 15 minute.

         • Soluția trebuie făcută zilnic proaspăt, iar porțiunea neutilizată trebuie aruncată.
         • Alternativ, reactivul poate fi distribuit în 1 ml alicote și păstrat congelat la -20 ° C. Aliquotele trebuie scoase din congelator și dezghețate înainte de utilizare. Aruncați porțiunea neutilizată în fiecare zi când se dezgheță reactivul.

   2. Efectuarea testului oxidazei lui Kovac

      Metoda hârtiei de filtrare

      1. Creste izolata (ele) care urmează să fie testată timp de 18-24 ore pe un BAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Pe o suprafață neporoasă (adică farfurie Petri sau farfurie de sticlă), udați o fâșie de hârtie filtrantă cu câteva picături de reactiv oxidaza Kovac.
      3. Lasă banda de hârtie filtrantă să se usuce înainte de utilizare.

      4. Folosiți o buclă de plastic de unică folosință, o buclă de inoculare a platinei sau un stick aplicator din lemn pentru a alege o porțiune dintr-o colonie din creșterea peste noapte pe BAP și frecați-o pe hârtia de filtrare tratată (figura 4).

         Nu folosiți o buclă de nichrom, deoarece poate produce o reacție fals-pozitivă

      5. Respectați hârtia de filtru pentru a schimba culoarea în violet.
      6. Efectuați etapele 3 și 4 cu o tulpină QC pozitivă și negativă pentru a vă asigura că reactivul oxidazei funcționează corect.

      

      Figura 4. Testul Kovac oxidazei: o reacție negativă și pozitivă pe metoda de hârtie filtrantă

      Metoda plăcii

      1. Creste izolata (ele) care urmează să fie testată timp de 18-24 ore pe un BAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      2. Eliminați câteva picături din reactivul oxidazei Kovac direct deasupra câtorva colonii suspecte care cresc în intervalul 18-24 de ore BAP.

         Nu inundați întreaga placă, deoarece bacteriile expuse reactivului nu sunt de obicei viabile pentru subcultură

      3. Înclinați placa și observați coloniile pentru o schimbare de culoare spre violet.
      4. Efectuați etapele 1 și 2 cu o tulpină QC pozitivă și negativă pentru a vă asigura că reactivul oxidazei funcționează corect.

   3. Citirea rezultatelor testului oxidazei

      • Reacțiile pozitive se vor dezvolta în decurs de 10 secunde sub forma unei culori purpurii în care bacteriile au fost aplicate pe hârtia de filtrare tratată. Reacțiile întârziate sunt puțin probabile cu N. meningitidis.
      • Reacțiile negative nu vor produce o schimbare de culoare pe hârtia de filtrare tratată.

2. Utilizarea carbohidraților prin N. meningitidis: metoda agarului cistinei tripticazei (CTA) Testele de utilizare a carbohidraților sunt utilizate pentru a valida identificarea unei tulpini ca N. meningitidis. Pentru această procedură, se adaugă 4 carbohidrați diferiți (glucoză [denumită și dextroză], maltoză, lactoză și zaharoză) în tuburi care conțin o bază CTA pentru o concentrație finală de 1%. Un mediu de fenol roșu este, de asemenea, inclus în mediu. Este un indicator sensibil care dezvoltă o culoare galbenă în prezența acidului la un pH de 6, 8 sau mai puțin. Un panou format din patru tuburi, fiecare conținând un carbohidrat diferit, este utilizat pentru a testa fiecare izolat. Neisseria spp. produce acid din carbohidrați prin oxidare, nu prin fermentare. N. meningitidis oxidează glucoza și maltoza, dar nu lactoză sau zaharoză. Deși este extrem de rară, s-a raportat că tulpinile de N. meningitidis utilizează fie glucoză, fie maltoză, dar nu ambele. Tulpinile de QC bine caracterizate trebuie testate împreună cu izolatele necunoscute pentru a vă asigura că zaharurile CTA funcționează corect. Pentru menținerea zahărului CTA trebuie utilizate N. N. meningitidis și / sau izolat N. lactamica. Metodele de preparare a mediului de zahăr CTA sunt incluse în anexă. Zaharurile CTA trebuie păstrate la 4 ° C și încălzite la temperatura camerei (25 ° C) înainte de utilizare.

   1. Efectuarea testării zahărului CTA

      1. Creste izolata (ele) care urmează să fie testată timp de 18-24 ore pe un BAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Lăsați cele 4 zaharuri CTA, glucoză (denumită și dextroză), maltoză, lactoză și zaharoză, să se încălzească la temperatura camerei (25 ° C) și etichetați tuburile cu ID-ul laboratorului.
      3. Îndepărtați 3-5 colonii din creșterea peste noapte pe BAP folosind o buclă de unică folosință.

      4. Înțepăți zahărul CTA de mai multe ori în 10 mm superiori de mediu. Aproximativ 8 înțepături cu aceeași buclă sunt suficiente.

         Utilizați o buclă de unică folosință separată pentru inocularea fiecărui carbohidrat care urmează să fie testat

      5. Fixați capacul cu șurub al fiecărui tub și așezați tuburile într-un incubator de 35-37 ° C fără CO ₂. Incubați zaharurile CTA timp de cel puțin 72 de ore (și până la 5 zile) înainte de a le elimina ca fiind negative.
      6. Respectați zaharurile CTA pentru dezvoltarea turbidității vizibile și schimbarea culorii la galben.
      7. Efectuați etapele 1-5 folosind un N. meningitidis, N. lactamica și o tulpină N. sicca QC pentru a vă asigura că zaharurile CTA funcționează corect.

   2. Citirea rezultatelor zahărului CTA Dezvoltarea turbidității vizibile și a unei culori galbene în porțiunea superioară a mediului indică creșterea bacteriilor și producția de acid și este interpretată ca un test pozitiv (figura 5). Deși reacțiile pot apărea încă din 24 de ore de la inoculare, unele reacții întârzie și rezultatele negative nu ar trebui interpretate înainte de 72 de ore de incubare. O schimbare de culoare la galben fără turbiditate nu este de obicei o reacție pozitivă. Rezultatele utilizării carbohidraților pentru diferențierea N. meningitidis de alte Neisseria spp. iar bacteriile sunt enumerate în tabelul 1.

      

      Figura 5. Reacții de zahăr CTA pentru N. meningitidis cu utilizarea de glucoză (dextroză) și maltoză, indicate prin producția de acid (schimbarea culorii la galben) și nici o utilizare a lactozei sau zaharozei

      Tabelul 1. Utilizarea carbohidraților de către unele Neisseria și Moraxella spp.

      Producția de acid din:

      Tabelul 1. Utilizarea carbohidraților de către unele Neisseria și Moraxella spp.

      Organism	Glucoză 1	Maltoză	Lactoză	zaharoza
      Neisseria meningitidis	+	+	-	-
      Neisseria lactamica	+	+	+	-
      Neisseria gonorrhoeae	+ 2	-	-	-
      Neisseria sicca	+	+	-	+
      Catarhalis Moraxella	-	-	-	-

      Afișați mai multe

      Note de subsol

      • ¹ Glucoza mai poate fi denumită dextroză.
      • ² Unele tulpini de N. gonorrhoeae sunt producători de acid slab și pot părea a fi glucozegative în mediu CTA.

3. Identificarea serogrupurilor de N. meningitidis Serogrupurile de trei, bazate pe compoziția biochimică a polizaharidelor capsulare, sunt recunoscute în prezent: A, B, C, H, I, K, L, W135, X, Y, Z și 29E (Z '). Serogrupul D nu mai este recunoscut ca serogrup. Serogrupurile A, B, C, W135 și Y sunt cele mai frecvente 5 cauze ale meningitei bacteriene. Serogrupul A a fost cea mai frecventă cauză de epidemii în Africa și Asia. Serogrupele C, W135 și X au fost, de asemenea, raportate ca și cauze ale epidemiilor în mai multe părți ale Africii. Antisera specifică serogrupurilor pentru aceste serogrupuri majore sunt disponibile comercial. Nu este întotdeauna practic să se testeze toate serogrupurile pentru care sunt disponibile antiserici într-un laborator. Algoritmii de testare pot fi stabiliți în laboratoare cu cunoștințe anterioare despre predominanța sau lipsa serogrupurilor din acea regiune geografică specială pentru a testa mai întâi cele mai comune serogrupuri. Modificările la algoritmul de testare pentru orice laborator se bazează pe informații despre tulpinile curente care circulă în regiune. De exemplu, în Africa, testarea cu antisera pentru serogrupele A și W135 (și X în unele regiuni), precum și cu un control salin pentru detectarea autoaglutinării nespecifice ar trebui să fie adecvată pentru a caracteriza majoritatea izolatelor de caz. Tulpinile care reacționează negativ cu antisera A, W135 și X trebuie apoi testate cu alte antiseruri disponibile, în special C, Y și B. Aproape toate izolatele de caz sunt serogrupabile, dacă sunt testate pe un panou cuprinzător de antiserici și se utilizează controale adecvate.. În cazuri rare, un izolat care nu reacționează cu niciun antisera specific serogrupului sau care reacționează cu mai mult de un antisera specific serogrupului este considerat nongroupabil (NG). De asemenea, pot fi utilizate antiseruri polivalente care conțin combinații de serogrupuri (de exemplu, A, B și C sau X, Y, W135 și Z). Este esențial ca laboratoarele de referință să aibă capacitatea de a izola, identifica și caracteriza serogrupul izolatelor. de N. meningitidis. Aceste date valoroase oferă laboratoarelor și autorităților de sănătate publică instrumentele pentru identificarea focarelor controlabile prin campaniile de vaccinare, recunoașterea serogrupurilor care provoacă boala sporadică și detectarea apariției de noi tulpini de focar.

   1. Test de serogrupare cu aglutinare diapozitivă (SASG) pentru izolarea serogrupului N. meningitidis. Suspensiile meningococice ucise de formalin ar trebui utilizate pentru testarea SASG, mai degrabă decât suspensiile saline ale organismelor vii pentru a menține un mediu de lucru sigur. O soluție de 5% soluție salină fiziologică formalinizată este suficientă pentru a omorî bacteriile. Cu toate acestea, formalina este un cancerigen și trebuie păstrată și manipulată cu mare atenție. În mod alternativ, munca trebuie efectuată sub capota biosecurității dacă nu este utilizată formalina. Antisera trebuie păstrată la frigider la 4 ° C și încălzită la temperatura camerei (25 ° C) înainte de utilizare. Trebuie să fie pus din nou în frigider imediat ce se termină testarea pentru a preveni pierderea activității de legare a anticorpului.

   2. Efectuarea testului SASG

      1. Creste izolata (ele) care urmează să fie testată timp de 18-24 ore pe un BAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Curățați o lamelă de sticlă cu alcool (opțional dacă lamelele sunt curățate în prealabil).

      3. Împărțiți diapozitivul în secțiuni egale (de exemplu, douăsprezece secțiuni de 11 X 22 mm pe o lamelă standard de 50 X 75 mm) cu un stilou impermeabil lichid sau un creion de ceară.

         Fiecare izolat va necesita cât mai multe secțiuni pe diapozitiv, antisera individuală specifică serogrupului care va fi testată, precum și un control negativ salin

      4. În porțiunea inferioară a fiecărei secțiuni a lamelelor de sticlă descrise la etapa (2), se adaugă 10 ul din soluția salină formalizată 5% cu un micropipetor.

         • Instrucțiunile specifică utilizarea unui micropipetor cu vârfuri filtrate sterilizate pentru a măsura 10 pl de soluție salină formalinizată de 5% pentru a suspenda bacteriile. Micropipetorul va transfera măsurători precise și egale pentru o reacție SASG adecvată.
         • Dacă un micropipetor și vârfuri nu sunt disponibile, bucle de inoculare sterile, de unică folosință, de unică folosință pot fi folosite pentru a transfera 10 pl de soluție salină formalinizată cu 5%, dar adesea nu furnizează cantități exacte (între 5-10 pl).
      5. Utilizați o buclă de inoculare sterilă de unică folosință de 10 ul pentru a colecta câteva colonii de la suprafața culturii peste noapte incubate pe BAP.

      6. Suspendează bacteriile din soluția salină formalinizată cu 5% din porțiunea inferioară a fiecărei secțiuni a lamelei. Suspensia trebuie să fie moderat opacă (vezi controlul salin din figura 6). Nu lăsați suspensia celulară să se usuce înainte de a adăuga antisera.

         Dacă bacteriile sunt greu de suspendat direct pe lamelă, faceți o suspensie moderată lași (comparabilă cu standardul McFarland 6) din cultura testului într-un flacon mic, cu 250 ul de 5% soluție salină formalinizată și scurt vortex suspensia pentru a se amesteca și rupe orice peleti. Adăugați 10 ui din această suspensie în porțiunea inferioară a lamelei

      7. În porțiunea superioară a fiecăreia dintre secțiunile diapozitivei de sticlă descrise la etapa (2), se adaugă 10 ul de antiseruri specifice serogrupului care urmează să fie testat, precum și soluție salină neformalinizată sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) pentru un control negativ cu un micropipetor.

         • NU folosiți picuratorul furnizat cu antisera, deoarece de obicei oferă cantități mai mari decât este necesar și poate fi contaminat cu ușurință.
         • Dacă un micropipetor și vârfuri nu sunt disponibile, bucle de inoculare sterile, de unică folosință, de unică folosință pot fi utilizate pentru a transfera 10 pl de antiseră, dar adesea nu furnizează cantități exacte (între 5-10 pl).
         • Eliminați vârful sau bucla folosită pentru a transfera antisera pe diapozitiv într-un recipient de deșeuri după fiecare utilizare, pentru a evita contaminarea antiserului. Dacă sursa de antiserici este contaminată, trebuie utilizat un flacon nou.
      8. Înclinați ușor diapozitivul pentru a amesteca suspensiile celulare cu antisera din fiecare secțiune. Continuați să balansați ușor diapozitivul timp de 1 până la 2 minute pentru a permite porțiunile inferioare și superioare să se amestece complet. Nu folosiți o mișcare circulară în timp ce balansează, deoarece poate provoca secțiunile cu diferite antiseruri specifice serogrupului să se alăture și să se contamineze reciproc.
      9. După 2 minute, examinați reacțiile SASG sub o lumină strălucitoare și pe un fundal negru. Utilizați sistemul de evaluare din figura 6 pentru a determina intensitatea reacției de aglutinare în fiecare secțiune a lamelei. Nu luați în considerare orice aglutinare care apare după perioada de 2 minute.
      10. Înregistrați rezultatele SASG în registrul de jurnal al laboratorului.

   3. Citirea rezultatelor SASG

      1. Evaluarea intensității reacției de aglutinare Aglutinarea apare atunci când antisera se leagă de celulele bacteriene, determinând aglutinarea sau aglomerarea celulelor împreună, făcând astfel suspensia celulară să pară mai clară. Intensitatea reacției de aglutinare poate varia în funcție de densitatea suspensiei celulare sau a antiserului utilizat. O descriere a gradelor de intensitate prezentate în figura 6 este prezentată mai jos.4 + Toate celulele se aglutinează și suspensia celulară este clar

         3+ 75% din celule se aglutinează și suspensia celulară rămâne ușor tulbure

         2+ 50% din celule se aglutinează și suspensia celulară rămâne ușor tulbure

         1+ 25% din celule se aglutinează și suspensia celulară rămâne ușor tulbure

         +/- Mai puțin de 25% din celule se aglutină și apare o materie granulară fină

         0 Fără aglutinare vizibilă; suspensia rămâne tulbure și netedă

         

         Figura 6. Evaluarea intensității reacției de aglutinare

      2. Determinarea serogrupului

         • Un rezultat pozitiv este desemnat de un 3+ sau 4+ (aglutinare puternică) în 1-2 minute, cu excepția serogrupului B, care este considerat pozitiv cu un grad de 2+ sau mai mare.
         • Un rezultat negativ este desemnat de 0 (soluție salină), +/-, 1+ sau 2+ (slabă aglutinare).
         • Serogrupul este determinat atunci când apare un rezultat pozitiv doar cu unul dintre antiserici și nu cu soluția salină.

         • Dacă un serogrup nu este determinat, izolatul este considerat NG. Următoarele combinații de rezultate sunt raportate ca NG:

           • Aglutinarea în soluție salină, indiferent de reacțiile puternice cu alte antiserici, caracterizează cultura drept autoaglutinant.
           • Aglutinarea cu mai mult de un antisera specific serogrupului în absența aglutinării în soluție salină caracterizează cultura drept polaglutinant sau reactiv încrucișat.
           • Nicio aglutinare cu oricare dintre antisera sau soluția salină nu caracterizează tulpina drept neactivă.

   4. Procedeele de depanare a izolațiilor N. meningitidis sunt supuse unei variabilități (încapsulate vs. neîncapsulate, mici față de coloniile mari, cultivatorii lente față de cultivatorii repezi și aglutinatorii grei față de aglutinatorii ușori) și pot fi neclari sau dificil de interpretat. Câteva proceduri de depanare sunt enumerate mai jos:

      1. Repetați testul direct pe lamă folosind creșterea dintr-o altă secțiune a aceleiași plăci.
      2. Realizați o suspensie de celule într-un tub mic și vortex dacă rezultatul SASG direct pe lamelă nu este clar și repetați testul.
      3. Adăugați 20 ui de antiserici direct pe lamelă și apoi adăugați o buclă plină de organism fără a dilua epruveta cu 5% soluție salină formalinizată.
      4. Subcultura și reluarea creșterii proaspete a doua zi.

      5. Dacă placa originală conține colonii de dimensiuni diferite, faceți o subcultură pentru fiecare tip de colonie și testați ambele culturi a doua zi. Coloniile mai mari indică de obicei o mai bună producție de capsule și, prin urmare, o reactivitate mai bună. Cu toate acestea, coloniile mai mici vor da ocazional un rezultat mai bun.

         Dacă discrepanțele nu sunt rezolvate imediat, orice repetări ulterioare ale SASG ar trebui utilizate împreună cu tulpinile de control

   5. Controlul calității antiserarelor pentru testarea SASG Trebuie utilizat un set de tulpini de referință pentru serogrupurile N. meningitidis A, B, C, W135, X, Y, Z, 29E (una per serogrup) și o tulpină N. meningitidis neagrupabilă pentru QC antisera înainte de a testa orice izolate necunoscute. QC al antisera ar trebui să fie:

      • Realizat pentru fiecare lot nou de antiseruri recepționate în laborator.
      • Se efectuează bianual după testarea inițială a QC.
      • Se repetă dacă un flacon a fost expus la temperaturi peste 4 ° C sau dacă există motive să se suspecteze că flaconul a fost contaminat de la efectuarea controlului inițial.

      Urmați procedura de testare SASG pentru a controla fiecare lot de antiserici utilizând toate tulpinile de referință disponibile în laborator. Înregistrați rezultatele furnizate pe foaia de exemplu QC din figura 7.

      Citirea rezultatelor testelor QC

      Test de trecere:

      • Antiserumul trebuie să administreze 3+ sau 4+ aglutinare cu antigene omoloage în 1-2 minute.
      • Antisericul nu trebuie să reacționeze cu serogrupuri heterologe N. meningitidis, cu tulpina de referință NG sau cu soluție salină.

      Proba eșuată:

      Antiserumul se aglutinează cu una sau mai multe tulpini de referință și / sau cu tulpina de referință NG și / sau în soluție salină

      Figura 7. Exemplu de fișă QC pentru testarea antiserurilor împotriva tuturor serogrupurilor N. meningitidis

      	A (număr de tulpină)	B (număr de tulpină)	C (număr de tulpină)	W135 (număr de tulpină)	X (număr de tulpină)	Y (număr de tulpină)	Z (număr de tulpină)	29E (Z ') (număr de tulpină)	NG (număr de tulpină)
      A Mult#	++	-	-	-	-	-	-	-	-
      B Mult#	-	++	-	-	-	-	-	-	-
      C Mult#	-	-	++	-	-	-	-	-	-
      W135 Mult#	-	-	-	++	-	-	-	-	-
      X Mult#	-	-	-	-	++	-	-	-	-
      Z Mult#	-	-	-	-	-	++	-	-	-
      29E Mult#	-	-	-	-	-	-	-	++	-
      salin	-	-	-	-	-	-	-	-	-

      Afișați mai multe

      Figura 7. Exemplu de fișă QC pentru testarea antiserurilor împotriva tuturor serogrupurilor N. meningitidis

4. Truse de identificare comercială Există mai multe sisteme de identificare comercială care utilizează substraturi biochimice sau enzimatice pentru identificarea Neisseria spp. Aceste sisteme pot necesita ocazional teste suplimentare și trebuie luate în considerare caracteristici suplimentare, cum ar fi morfologia microscopică și colonială. În general, fiecare sistem este de sine stătător, dar poate fi necesară adăugarea unuia sau mai multor reactivi pentru a completa anumite reacții. Instrucțiunile producătorului trebuie respectate cu exactitate atunci când utilizați aceste truse. Pentru instrucțiuni detaliate și utilizarea tulpinilor de control adecvate, consultați Manualul de proceduri de microbiologie clinică (2).

5. Serotiparea și serosubtypingul N. meningitidis cu anticorpi monoclonali (Mabs) Diferențierea și clasificarea tulpinilor bacteriene la nivelul sub-speciilor necesită metode foarte reproductibile, puțin afectate de condițiile experimentale și care oferă o discriminare eficientă a tulpinilor fără legătură epidemiologică. Caracterizarea suplimentară a bacteriilor care provoacă meningită este deosebit de importantă pentru a documenta răspândirea clonelor în special patogene. Au fost dezvoltate numeroase teste imunologice pentru caracterizarea serologică a antigenelor N. meningitidis. Detectarea imunologică a epitopilor specifici a două proteine majore ale membranei externe, PorB și PorA, stă la baza sistemului de clasificare serologică care definește, respectiv, serotipurile și serosubtipurile speciilor 1, 3-7). Mai jos este descrisă o metodă simplă, cu costuri reduse pentru serotiparea și serosubtyping meningococ, punct-blotting cu Mabs.

   1. Pregătirea suspensiilor cu celule întregi

      Suspensiile cu celule întregi nu trebuie utilizate pentru testarea PCR

      1. Creste izolat N. meningitidis pentru a fi testat împreună cu un izolat de referință adecvat pentru QC pe un BAP timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Colectați 3-5 colonii folosind o buclă sterilă de unică folosință sau tampon steril și suspendați în 1 ml PBS (pH = 7, 2) cu 0, 02% sodiu-azidă.
      3. Inactivați bacteriile prin încălzirea suspensiei la 60 ° C timp de 30 de minute.
      4. Reglați densitatea optică cu PBS la 0, 2 măsurată la 650 nm (echivalent cu un McFarland 1.5).
      5. Mențineți suspensiile cu celule întregi la 4 ° C până la utilizare.

   2. Efectuarea testului de serotyping / serosubtyping punct-blotting

      1. Tăiați benzi (0, 5 x 10 cm) de hârtie nitroceluloză (pori 0, 45 um). Împărțiți fiecare bandă în 10 secțiuni de 1 cm lungime folosind un creion de ceară și aliniați-le pe o sticlă sau pe o placă de plastic dur.

         Folosiți mănuși și / sau forceps atunci când manipulați hârtie nitroceluloză

      2. Etichetați benzile cu un stilou permanent în secțiunea din stânga.
      3. Punctul 2 ui din suspensia de celule întregi a unui izolat de referință relevant la mijlocul secțiunii marcate următoare și 2 ui din test se izolează succesiv pe fiecare dintre secțiunile următoare, așa cum se arată în figura 8.
      4. Uscați benzile timp de 15 minute sau mai mult.
      5. Adăugați 2 ml de tampon de blocare (PBS suplimentat cu albumină serică de bovin 3% [BSA]) în fiecare godeu a unei tăvii de incubație cu 8 godeuri (tăvile cu 8 godeuri cu capace sunt disponibile comercial).

      6. Transferați benzile care urmează să fie testate cu același Mab într-un puț (maxim 4 benzi pe godeu). Se amestecă ușor timp de 30 de minute. Benzile trebuie umezite complet de tamponul de blocare.

         Volumul minim de incubație al tamponului de blocare pentru o bandă este de 0, 5 ml. Până la 4 benzi cu aproximativ 40 de probe punctate pot fi incubate într-un volum total de 2 ml. Luați în considerare să lăsați un puț gol în tăvile de incubație între fiecare set de benzi care sunt incubate cu MAB diferite

      7. Adăugați Mab în puțurile respective. În funcție de furnizorul Mab, diluția finală poate varia de la 1:10 la 1: 500.000.
      8. Puneți capacul pe tava de incubație și incubați cu amestecare blândă peste noapte.
      9. Îndepărtați cu atenție soluțiile de anticorpi din benzi folosind un vârf de pipet conectat la o pompă de aspirație sau un dispozitiv similar. Clătiți vârful cu apă între fiecare set de benzi care au fost incubate cu diferite Mabs pentru a preveni transferul de Mabs.
      10. Clătiți benzile de 3 ori cu cel mult 2 ml PBS direct în godeuri. Eliminați PBS în același mod în care s-au îndepărtat soluțiile de anticorp.
      11. Se adaugă 2 ml de PBS suplimentat cu 3% BSA cu anticorp anti-mouse de iepure marcat cu peroxidază de hrean (utilizat în mod obișnuit la o diluție de 1: 2.000) și se incubează timp de 2 ore cu amestecare blândă. Asigurați-vă că benzile sunt umezite complet.
      12. Clătiți benzile în 2 ml de PBS timp de 5 minute de două ori mai mult decât în pasul 9.
      13. Spălați benzile timp de câteva minute într-un tampon de 0, 05 M acetat de sodiu, pH 5, 0, apoi aruncați soluția.
      14. Introduceți benzile într-o cutie de plastic și adăugați 10 ml de tampon de acetat de sodiu cu 0, 4 ml de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) în dimetilformamidă (DMF). Se amestecă timp de 2-3 minute.
      15. Adăugați 10 ui de H2O2 la 30% și colorați fiecare punct până când sunt observate puncte roșii distincte pentru izolatul de referință (2-10 minute).

      

   3. Citirea rezultatelor testului de serotipare / serosubtyping punct-blotting

      1. Clătiți benzile sub apă curentă, aliniați-le pe o placă de sticlă și absorbiți excesul de apă cu hârtie de filtru sau înclinați ușor placa pentru a usca benzile la temperatura camerei (25 ° C).
      2. Notează intensitatea de colorare a fiecărui punct (pozitiv, slab sau negativ) în raport vizual cu tulpina de referință.
      3. Când sunt uscate, benzile pot fi tapetate pe o foaie de hârtie și păstrate într-un buzunar de plastic ferit de lumină.

Referințe

1. Arhin, FF, F. Moreau, JW Coulton și EL Mills. Proteine ale membranei exterioare și serosubtyping cu vezicule ale membranei exterioare din izolate clinice ale Neisseria meningitidis. Microbiologie actuală. 1997; 34: 18-22.
2. Manual de proceduri de microbiologie clinică, ediția a III-a. ASM. Washington, DC 2010; 2.540 de pagini.
3. Frasch, CE, WD Zollinger și JT Poolman. Antigene serotip ale Neisseria meningitidis și o schemă propusă pentru desemnarea serotipurilor. Rev Infect Dis. 1985; 7: 504-510.
4. Poolman, JT, P. Kriz-Kuzemenska, F. Ashton, W. Bibb, Dankert J, Demina A și colab. Serotipuri și subtipuri de Neisseria meningitidis: rezultatele unui studiu internațional care compară sensibilitățile și specificitățile anticorpilor monoclonali. Imunologie de laborator clinic și diagnostic. 1995; 2: 69-72.
5. Sacchi, CT, AP Lemos, ME Brandt, AM Whitney, CE Melles, CA Solari și colab. Standardizarea propusă a Neisseria meningitidis PorA Nomenclator de scriere cu regiune variabilă. Imunologie de laborator clinic și diagnostic. 1998; 5: 845-855.
6. Sacchi, CT, AP Lemos, AM Whitney, CA Solari, ME Brandt, CE Melles și colab. Corelația dintre analizele serologice și de secvențiere a proteinei membranei externe PorB în sistemul de serotipare Neisseria meningitidis. Imunologie de laborator clinic și diagnostic. 1998; 5: 348-354.
7. Swaminathan, B., GM Matar, MW Reeves, LM Graves, GW Ajello, WF Bibb, și colab. Subtiparea moleculară a serogrupului B Neisseria meningitidis: compararea a cinci metode. Jurnalul de Microbiologie Clinică. 1996; 34: 1468-1473.

Începutul paginii