Meningită - Manual De Laborator - Depozitare și Transport-Neisseria

Pregătirea mediilor și a reactivilor

Versiunea pentru imprimantă Cdc-pdf [30 de pagini]

Controlul calității (QC) al materialelor

Fiecare lot de medii preparate în laborator și numărul de loturi al fiecărui producător nou trebuie testate folosind tulpini de referință QC adecvate pentru sterilitate, capacitatea de a sprijini creșterea organismului (organismelor) țintă și / sau capacitatea de a produce reacții biochimice adecvate.. Trebuie înregistrată o înregistrare QC pentru toate suporturile pregătite în laborator și achiziționate comercial; inclusiv data pregătirii sau a achiziției și rezultatele testelor QC. Ar trebui notată orice caracteristică neobișnuită a mediului, cum ar fi culoarea sau textura sau creșterea lentă a tulpinilor de referință.

1. Agar de rutină și mediu de bulion Toate mediile de agar trebuie preparate aseptic și distribuite în vasele Petri de 15 × 100 mm (15-20 ml per farfurie). După turnare, plăcile trebuie menținute la temperatura camerei (25 ° C) timp de câteva ore pentru a preveni formarea excesului de condens pe capacele vaselor. Pentru o creștere optimă, plăcile trebuie plasate într-o pungă de plastic sterilă și depozitate într-o poziție inversată la 4 ° C până la utilizare. Toate suporturile de bulion trebuie depozitate într-un recipient adecvat la 4 ° C până la utilizare.

   1. Placă de agar de sânge (BAP): agar de soia tripticază (TSA) + 5% sânge de oaie Un BAP este utilizat ca mediu general de agar de sânge. Este utilizat pentru creșterea și testarea N. meningitidis și S. pneumoniae. Placa trebuie să apară o culoare roșie strălucitoare. Dacă plăcile par roșu închis, acestea sunt fie vechi, fie sângele era probabil adăugat atunci când agarul era prea cald. În caz afirmativ, suportul ar trebui aruncat și ar trebui pregătit un lot nou.

      Pregătirea media

      1. Pregătiți volumul de TSA necesar într-un balon conform instrucțiunilor date pe eticheta pulberii deshidratate.

         • Este convenabil să se pregătească 500 ml de agar topit într-un balon de l-2 litri. Dacă se folosește pulbere de bulion TSA, se adaugă 20 g agar în 500 ml de apă distilată.
         • Mediile trebuie încălzite și dizolvate complet fără pulbere pe pereții vasului înainte de autoclavare.
      2. Autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.
      3. Se răcește la 60 ° C într-o baie de apă.

      4. Se adaugă 5% sânge de oaie steril și defibrinat (5 ml sânge de oaie poate fi adăugat la 100 ml de agar).

         Dacă se prepară un volum diferit de mediu bazal, cantitatea de sânge adăugată trebuie ajustată în consecință la 5% (de exemplu, 50 ml sânge pe litru de mediu). NU folosiți sânge uman

      5. Se distribuie 20 ml în vasele Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
      6. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

      Control de calitate

      1. Creste o tulpină de S. pneumoniae sau o tulpină de N. meningitidis QC timp de 18-24 ore pe un BAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Respectați BAP pentru morfologia și hemoliza specifică a coloniilor.
      3. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      Rezultatul trecerii:

      • S. pneumoniae trebuie să apară ca colonii mici, de culoare gri până la gri-verde, înconjurate de un halou verde distinct (alfa-hemoliză).
      • N. meningitidis ar trebui să apară ca colonii mari, rotunde, netede, umede, strălucitoare și convexe, gri, cu o margine clar definită pe BAP.
      • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   2. Bulion de cultură de sânge Mediul de cultură Blood este utilizat pentru a crește N. meningitidis, S. pneumoniae și H. influenzae.

      Pregătirea media

      1. Urmați instrucțiunile producătorului de pe eticheta fiecărei sticle de bulion de soia tripticază deshidratată ( TSB).

      2. Se adaugă 0, 25 g de polianololsulfonat de sodiu (SPS) la un litru de mediu.

         SPS este deosebit de important pentru recuperarea H. influenzae

      3. Se distribuie în 20 ml (pentru o sticlă de cultură de sânge pediatrică) și 50 ml (pentru o sticlă de cultură de sânge pentru adulți) în recipiente adecvate (tuburi sau sticle) cu șuruburi cu șurub cu diafragme de cauciuc.

         Cantitatea de lichid din recipiente trebuie să reprezinte cel puțin două treimi din volumul total al recipientului

      4. Autoclave la 121 ° C timp de 15 minute.
      5. Se lasă să se răcească și se păstrează mediu la temperatura camerei (25 ° C).

      Control de calitate

      1. Cresc tulpini de N. meningitidis, S. pneumoniae și H. influenzae QC timp de 18-24 ore pe un BAP sau CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Adăugați 1-3 ml de iepure steril, cal sau sânge uman la 3 sticle de mediu de cultură a sângelui proaspăt preparat.
      3. Colectați o bucată de creștere peste noapte de la fiecare dintre plăcile de bacterii și suspendați-o în 1-2 ml de bulion de cultură de sânge (un organism diferit pentru fiecare sticlă).
      4. Inoculați suspensiile bacteriene în cele 3 sticle de cultură de sânge.
      5. Incubați flacoanele de cultură de sânge la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) până la 7 zile și observați creșterea.
      6. Subcultura bacteriilor pe medii adecvate la 14 ore și 48 ore.
      7. Ca test de sterilitate, incubați o sticlă de cultură de sânge neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      Rezultatul trecerii:

      • Toate cele trei bacterii trebuie recuperate pe medii adecvate după 24 și 48 de ore.
      • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   3. Placa de agar de ciocolată (CAP) CAP este un mediu care acceptă cerințele speciale de creștere (hemin și NAD) necesare pentru izolarea organismelor fastidioase, cum ar fi H. influenzae, atunci când sunt incubate la 35-37 ° C într-o atmosferă de 5% CO ₂.. CAP are o concentrație redusă de agar, ceea ce crește conținutul de umiditate al mediului. Poate fi preparat cu sânge de cal calificat, care este o sursă bună atât de hemin, cât și de NAD, deși poate fi folosit și sânge de oaie. Creșterea are loc pe o PAC, deoarece NAD este eliberat din sânge în timpul procesului de încălzire a preparatului de agar de ciocolată (procesul de încălzire inactivează și inhibitorii de creștere), iar heminul este disponibil de la celulele sanguine neemolizate și hemolizate.

      Pregătirea media

      1. Încălziți un volum de sânge de cal sau oaie, care este de 5% din volumul total de medii care se prepară foarte lent la 56 ° C într-o baie de apă.
      2. Se distribuie 20 ml în vasele Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
      3. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.
      4. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      Control de calitate

      1. Cresc tulpini de N. meningitidis, S. pneumoniae și H. influenzae QC timp de 18-24 ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Observați PAC pentru morfologia și hemoliza specifică a coloniilor.

      Rezultatul trecerii:

      • N. meningitidis și H. influenzae ar trebui să apară sub formă de colonii opace mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, fără decolorarea mediului.
      • S. pneumoniae ar trebui să apară sub formă de colonii gri până la verzi cu o zonă de alfa-hemoliză (doar puțin verde) pe PAC.
      • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   4. CAP cu bacitracinCAP cu bacitracină este un mediu selectiv utilizat pentru a îmbunătăți izolarea primară de H. influenzae din exemplarele care conțin o floră mixtă de bacterii și / sau ciuperci.

      Pregătirea media

      1. Preparați TSA cu rezistență dublă (20 g în 250 ml apă distilată) ca mediu bazal.
      2. Autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.

      3. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.

         Folosiți un termometru pentru a verifica temperatura din baia de apă

      4. Se prepară o soluție de 2% hemoglobină (5 g în 250 ml apă distilată). Se amestecă hemoglobina în 5-6 ml de apă distilată pentru a forma o pastă netedă. Continuați să amestecați pe măsură ce se adaugă restul de apă.
      5. Autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.
      6. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.

      7. Se adaugă soluția de hemoglobină la TSA cu dublă rezistență și se menține în continuare la 50 ° C.

         Dacă o soluție de hemoglobină nu este disponibilă, utilizați metoda alternativă cu sânge de oaie defibrinată descrisă mai jos:

         1. Adăugați 5% oaie sterilă defibrinată, iepure, cobai sau sânge de cal (5 ml sânge la 100 ml agar) la baza de agar TSA cu rezistență maximă (20 g în 500 ml apă distilată).

            NU folosiți sânge uman

         2. Se încălzește la 56 ° C într-o baie de apă, apoi se răcește la 50 ° C.

      8. După ce s-a adăugat soluția de hemoglobină sau sângele defibrinat la mediul de bază și mediul s-a răcit la 50 ° C, se adaugă suplimentul de creștere conținând hemin și NAD la o concentrație finală de 1%. Amestecați ingredientele rotind ușor balonul într-o mișcare din figura 8 pe tejghea.

         Evitați formarea de bule

      9. Pregătiți o soluție stoc de bacitracină suspendând 3 g bacitracină în 20 ml apă distilată. Se filtrează-sterilizează, se distribuie în cantități de 1 ml și se păstrează la -20 ° C sau -70 ° C.
      10. În timp ce mediul este încă la 50 ° C, se adaugă 1 ml soluție stoc de bacitracină (preparat la pasul 9) la 500 ml agar de ciocolată.
      11. Se distribuie 20 ml în vasele Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
      12. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

      Control de calitate

      1. Se cultivă o tulpină de H. influenzae QC timp de 18-24 ore pe un CAP cu bacitracină la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Observați PAC cu bacitracină pentru morfologie și hemoliză specifică a coloniilor.
      3. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      Rezultatul trecerii:

      • H. influenzae ar trebui să apară ca colonii opace, mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, cu bacitracină fără decolorare a mediului.
      • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   5. Agar de ciocolată cu TSA și supliment de creștere Agarul de ciocolată cu TSA și suplimente de creștere este un mediu care acceptă cerințele speciale de creștere (hemin și NAD) necesare pentru izolarea organismelor fastidioase, cum ar fi H. influenzae, atunci când sunt incubate la 35-37 ° C în o atmosferă de 5% CO ₂.

      Pregătirea media

      1. Preparați TSA cu rezistență dublă (20 g în 250 ml apă distilată) ca mediu bazal.
      2. Autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.

      3. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.

         Folosiți un termometru pentru a verifica temperatura din baia de apă

      4. Se prepară o soluție de 2% hemoglobină (5 g în 250 ml apă distilată). Se amestecă hemoglobina în 5-6 ml de apă distilată pentru a forma o pastă netedă. Continuați să amestecați pe măsură ce se adaugă restul de apă.
      5. Autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.
      6. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.

      7. Se adaugă soluția de hemoglobină la TSA cu dublă rezistență și se menține în continuare la 50 ° C. Dacă o soluție de hemoglobină nu este disponibilă, utilizați metoda alternativă cu sânge de oaie defibrinată descrisă mai jos:

         1. Adăugați 5% oaie sterilă defibrinată, iepure, cobai sau sânge de cal (5 ml sânge la 100 ml agar) la baza de agar TSA cu rezistență maximă (20 g în 500 ml apă distilată).

            NU folosiți sânge uman

         2. Se încălzește la 56 ° C într-o baie de apă, apoi se răcește la 50 ° C.

      8. După ce s-a adăugat soluția de hemoglobină sau sângele defibrinat la mediul de bază și mediul s-a răcit la 50 ° C, se adaugă suplimentul de creștere conținând hemin și NAD la o concentrație finală de 1%. Amestecați ingredientele rotind ușor balonul într-o mișcare din figura 8 pe tejghea.

         Evitați formarea de bule

      9. Se distribuie 20 ml în fiecare vas Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
      10. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

      Control de calitate

      1. Cresc tulpini de N. meningitidis, S. pneumoniae și H. influenzae QC timp de 18-24 ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Observați agarul de ciocolată cu TSA și suplimente de creștere pentru morfologia și hemoliza specifică a coloniilor.
      3. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      Rezultatul trecerii:

      • N. meningitidis și H. influenzae ar trebui să apară sub formă de colonii opace mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, fără decolorarea mediului.
      • S. pneumoniae ar trebui să apară sub formă de colonii gri până la verzi cu o zonă de alfa-hemoliză (doar puțin verde) pe PAC.
      • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   6. Agar de ciocolată cu bază de gonococ (bază GC) și supliment de creștere Agarul de ciocolată cu bază GC și supliment de creștere este un mediu care acceptă cerințele speciale de creștere (hemin și NAD) necesare pentru izolarea organismelor fastidioase, cum ar fi H. influenzae, atunci când sunt incubate la 35-37 ° C într-o atmosferă de 5% CO ₂.

      Pregătirea media

      1. Suspendă 7, 2 g bază de agar GC în 100 ml apă distilată într-un balon. Se amestecă bine, se încălzește cu agitație frecventă și se aduce la fierbere timp de 1 minut pentru a dizolva complet pulberea.
      2. Autoclavează balonul la 121 ° C timp de 15 minute.
      3. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.

      4. Se adaugă 100 ml apă distilată caldă la 2 g pulbere de hemoglobină solubilă. Amestecă pulberea cu 5-10 ml de apă distilată până când se obține o pastă netedă. Adăugați treptat echilibrul de apă până când soluția este omogenă. Amestecă continuu soluția în timpul adăugării de apă.

         În mod alternativ, se pot utiliza 100 ml soluție de hemoglobină sterilă pregătită 2%, încălzită la 50 ° C

      5. Autoclavează soluția la 121 ° C timp de 15 minute. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.
      6. Reconstituie suplimentul de creștere liofilizat conținând NAD și hemin prin transferul aseptic de 10 ml de diluant însoțitor cu un ac și seringă sterile. Agitați pentru a asigura o soluție completă. După reconstituire, utilizați imediat sau păstrați la 4 ° C și utilizați în 2 săptămâni.
      7. Se adaugă aseptic 100 ml soluție de hemoglobină sterilă și supliment de creștere la 100 ml soluție de bază de agar GC. Se amestecă ușor, dar bine, pentru a evita bule de aer în agar.
      8. Se distribuie 20 ml în vasele Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
      9. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

      Control de calitate

      1. Cresc tulpini de N. meningitidis, S. pneumoniae și H. influenzae QC timp de 18-24 ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Observați agarul de ciocolată cu TSA și suplimente de creștere pentru morfologia și hemoliza specifică a coloniilor.
      3. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      Rezultatul trecerii:

      • N. meningitidis și H. influenzae ar trebui să apară sub formă de colonii opace mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, fără decolorarea mediului.
      • S. pneumoniae ar trebui să apară sub formă de colonii gri până la verzi cu o zonă de alfa-hemoliză (doar puțin verde) pe PAC.
      • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.
   7. Înclinații de agar de ciocolată Înclinații de agar de ciocolată pentru transport și depozitare pe termen scurt pot fi preparate în același mod descris pentru plăcile de agar cu o diferență: 4 ml de mediu trebuie distribuiți în tuburi cu șurub cu șurub de 16 × 125 mm și înclinați înainte de solidificare. Covoarele de agar de ciocolată ar trebui să arate de culoare brună până la roșu-maroniu. Înclinațiile de agar de ciocolată trebuie testate pentru QC utilizând aceleași metode utilizate pentru testarea QC a CAP.

   8. Agar de cistină tripticază (CTA) cu 1% carbohidrat (un mediu semi-solid)

      Pregătirea media

      1. Urmați instrucțiunile producătorului pentru cantitatea de mediu CTA care se suspendă în 900 ml de apă distilată. Se amestecă bine, se încălzește cu agitație frecventă și se aduce la fierbere timp de 1 minut pentru a dizolva complet pulberea.
      2. Autoclavează balonul la 121 ° C timp de 15 minute.
      3. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.
      4. Pregătiți o soluție de glucoză 10% (numită și dextroză) adăugând 10 g glucoză la 100 ml apă distilată. Filtrează-sterilizează folosind un filtru de 0, 22 microni.
      5. Adăugați aseptic 100 ml soluție de glucoză 10% din etapa 4 până la 900 ml mediu CTA pentru a obține o concentrație finală de 1% glucoză.
      6. Se distribuie aseptic 7 ml de mediu în tuburi de sticlă cu șurub cu șurub de 16 × 125 mm.
      7. Repetați această procedură pentru restul de 3 carbohidrați: maltoză, lactoză și zaharoză.
      8. Depozitați la temperatura de 4 ° C și încălziți la temperatura camerei (25 ° C) înainte de utilizare.

      Control de calitate

      1. Cresc tulpini de N. meningitidis, N. lactamica și N. sicca QC pentru a fi testate timp de 18-24 ore pe un BAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Lăsați cele 4 zaharuri CTA, glucoză, maltoză, lactoză și zaharoză să se încălzească până la temperatura camerei (25 ° C) și etichetați tuburile cu numele tulpinii QC.
      3. Îndepărtați 3-5 colonii din creșterea peste noapte pe BAP folosind o buclă de unică folosință.

      4. Înțepăți zahărul CTA de mai multe ori în 10 mm superiori de mediu. Aproximativ 8 înțepături cu aceeași buclă sunt suficiente.

         Utilizați o buclă de unică folosință separată pentru inocularea fiecărui carbohidrat care urmează să fie testat

      5. Fixați capacul cu șurub al fiecărui tub și așezați tuburile într-un incubator de 35-37 ° C fără CO ₂. Incubați zaharurile CTA timp de cel puțin 72 de ore (și până la 5 zile) înainte de a arunca ca fiind negative.
      6. Respectați zaharurile CTA pentru dezvoltarea turbidității vizibile și schimbarea culorii la galben.

      Rezultatul trecerii:

      • Dezvoltarea turbidității vizibile și a unei culori galbene în porțiunea superioară a mediului indică creșterea bacteriilor și producția de acid și este interpretată ca un test pozitiv.
      • N. meningitidis ar trebui să utilizeze glucoză și maltoză, dar nu lactoză sau zaharoză.
      • N. lactamica ar trebui să utilizeze glucoză, maltoză și lactoză, dar nu zaharoză.
      • N. sicca ar trebui să utilizeze glucoză, maltoză și zaharoză, dar nu lactoză.

   9. Plăci de mediu Haemophilus (HTM) HTM este utilizat pentru testarea sensibilității antimicrobiene pentru H. influenzae.

      Pregătirea media

      Agarul Mueller-Hinton utilizat pentru a face HTM ar trebui să nu aibă timidină pentru a obține rezultate consistente dacă se testează susceptibilitatea la cotrimoxazol.

      1. Pregătiți o soluție din stoc de hemin proaspăt dizolvând 50 mg de hemin pulbere în 100 ml 0, 0 mol / L NaOH cu căldură și agitând până când pulberea este dizolvată complet.
      2. Se prepară o soluție de stoc din nicotinamidă adenină dinucleotidă (NAD) dizolvând 50 mg de NAD în 10 ml de apă distilată; filtru sterilizează.
      3. Preparați Mueller-Hinton agar (MHA) dintr-o bază deshidratată disponibilă în comerț conform instrucțiunilor producătorului (sau a se vedea protocolul în secțiunea IM), adăugând 5 g extract de drojdie și 30 ml soluție stoc de hemin la 1 L de MHA.
      4. După autoclavare, răciți mediul la 45 ° C până la 50 ° C într-o baie de apă.
      5. Se adaugă aseptic 3 ml soluție stoc NAD.

      6. Turnați agar în sticlă Petri cu fund plat sau plastic Petri pe o suprafață de turnare la nivel.

         • Măsurați 60-70 ml mediu pe placă în plăci 15 × 150 mm sau măsurați 25-30 ml pe placă în plăci 15 × 100 mm pentru a obține o adâncime uniformă de aproximativ 4 mm.
         • Plăcile trebuie să aibă o grosime uniformă de 3-4 mm, deoarece rata de difuzie a agenților antimicrobieni sau activitatea medicamentelor poate fi afectată.
         • Utilizarea mai mult sau mai puțin agar va afecta rezultatele susceptibilității.
      7. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.

      8. PH-ul trebuie să fie de 7, 2-7, 4.

         Nu încercați să reglați pH-ul mediului de test MHA dacă acesta se află în afara ariei

      9. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

      Control de calitate

      1. Cultivați o tulpină de H. influenzae QC timp de 18-24 ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Pregătiți o suspensie moderat de grea a celulelor (comparabilă cu un standard de 1, 0 McFarland) de la creșterea peste noapte pe PAC într-un bulion potrivit (soia tripticazei, infuzie cardiacă sau apă peptonică) și amestecați bine folosind un vortex.
      3. Inoculați o placă HTM cu 10 ul de suspensie celulară folosind o buclă sterilă și o fâșie pentru izolare.
      4. Observați placa HTM pentru morfologia specifică a coloniilor.
      5. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

      Rezultatul trecerii:

      • H. influenzae trebuie să pară coloniile opace mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, fără discolorare a mediului.
      • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   10. Agar de infuzie cardiacă (HIA) și agar de soia tripticază (TSA) HIA și TSA sunt medii de uz general utilizate cu sau fără sânge pentru izolarea și cultivarea unui număr de microorganisme. Mediile ar trebui să apară colorate de paie (de culoare galbenă până la auriu). HIA și TSA sunt de asemenea utilizate pentru determinarea cerințelor de creștere a heminului (factor X) și NAD (factor V) ale H. influenzae.

       Pregătirea media

       1. Pregătiți volumul de HIA sau TSA necesar într-un balon, conform instrucțiunilor de pe eticheta mediului deshidratat.

          Aceste medii ar trebui să fie dizolvate complet, fără pulbere pe pereții vasului, înainte de autoclavare

       2. Autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.
       3. Răciți la 50 ° C într-o baie de apă și distribuiți 20 ml în fiecare vas Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
       4. Plasați plăcile în pungi de plastic și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

       Control de calitate

       1. Cultivați o tulpină de H. influenzae QC timp de 18-24 ore pe un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

       2. Pregătiți o suspensie moderat de grea a celulelor (comparabilă cu un standard de 1, 0 McFarland) de la creșterea peste noapte pe PAC într-un bulion potrivit (soia tripticazei, infuzie cardiacă sau apă peptonică) și amestecați bine folosind un vortex.

          Nu transferați niciunul dintre mediile de agar de ciocolată de pe placă în suspensia celulară, deoarece chiar și cea mai mică cantitate de agar va afecta testul și poate duce la identificarea greșită a bacteriilor

       3. Inoculați o jumătate din placa HIA sau TSA cu 10 ul de suspensie celulară folosind o buclă sau un tampon steril și lăsați suspensia să se usuce.
       4. Puneți discuri de hârtie sau benzi care conțin hemin, NAD și hemin / NAD pe placa inoculată după ce inoculul s-a uscat.
       5. Invertiți cu atenție plăcile și incubați timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
       6. Observați creșterea pe placa HIA sau TSA din jurul discurilor sau benzilor de hârtie.
       7. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

       Rezultatul trecerii:

       • H. influenzae ar trebui să crească numai în jurul discului hemin / NAD.
       • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   11. Infuzia cardiacă placă de agar de sânge de iepure (HIA - sânge de iepure) Sânge de iepure HIA este utilizat pentru determinarea reacției hemolitice a speciilor Haemophilus. Acest mediu ar trebui să pară roșu aprins și să arate foarte asemănător cu BAP. Dacă mediul este roșu închis, ar trebui aruncat și trebuie pregătit un lot nou. Sângele de cal poate fi înlocuit cu sângele de iepure în acest mediu.

       Pregătirea media

       1. Pregătiți volumul de HIA necesar într-un balon conform instrucțiunilor de pe eticheta mediului deshidratat.
       2. Autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.
       3. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.
       4. Se adaugă 5% sânge de iepure steril și defibrinat (alternativ, se pot adăuga 5 ml sânge de oaie la 100 ml de agar).
       5. Se distribuie 20 ml în vasele Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
       6. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

       Control de calitate

       1. Creste o tulpină hemolitică de H. haemolyticus QC timp de 18-24 ore pe un sânge de iepure HIA la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

          După radierea plăcii cu pata de QC, înțepăți materialul cu bucla de inoculare

       2. Observă sângele iepure HIA pentru morfologia specifică a coloniilor și beta-hemoliză (clar).
       3. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

       Rezultatul trecerii:

       • H. haemolyticus ar trebui să apară ca colonii mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, și să fie înconjurate de o zonă distinctă de hemoliză completă care apare ca un halo clar care înconjoară coloniile.
       • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   12. Agar de sânge de cal (bază de agar de sânge) Acest mediu extrem de nutritiv poate fi utilizat pentru izolarea primară de H. influenzae și pentru determinarea hemolizei cu H. haemolyticus sau alte bacterii.

       Pregătirea media

       1. Pregătiți volumul de bază de agar de sânge necesar într-un balon conform instrucțiunilor producătorului de pe eticheta mediului deshidratat.
       2. Autoclave la 121 ° C timp de 15 minute.
       3. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.
       4. Se adaugă 5 ml sânge de cal la 100 ml de mediu.
       5. Amestecați bine și distribuiți 20 ml în vasele Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
       6. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

       Control de calitate

       1. Cultivați o tulpină hemolitică de H. haemolyticus QC timp de 18-24 ore pe o placă de agar de sânge de cal la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

          După radierea plăcii cu pata de QC, înțepăți materialul cu bucla de inoculare

       2. Observați agarul de sânge de cal pentru morfologie specifică a coloniilor și beta-hemoliză (clar).
       3. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

       Rezultatul trecerii:

       • H. haemolyticus ar trebui să apară ca colonii mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, și să fie înconjurate de o zonă distinctă de hemoliză completă care apare ca un halo clar care înconjoară coloniile.
       • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   13. MacConkey (MAC) agarMacConkey Agar este utilizat pentru izolarea și diferențierea bacteriilor enterice gram-negative de la lactoză de organismele care fermentează lactoza. Se recomandă ca mediul MAC să fie achiziționat comercial, deoarece prepararea acestuia cu ingrediente individuale produce variabilitate între loturi.

       Pregătirea media

       1. Pregătiți MAC conform instrucțiunilor producătorului.
       2. Sterilizați mediul prin autoclavare la 121 ° C timp de 15 minute.
       3. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.
       4. Se distribuie 20 ml în vasele Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
       5. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

       Control de calitate

       1. Se cultivă o tulpină de E. coli QC timp de 18-24 ore pe un MAC la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
       2. Respectați MAC pentru morfologia specifică a coloniilor.
       3. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

       Rezultatul trecerii:

       • E. coli ar trebui să apară ca roz la colonii roșii.
       • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   14. Mediul agar Thayer-Martin modificat (MTM) MMM este un mediu selectiv utilizat pentru a îmbunătăți izolarea primară a N. meningitidis din exemplarele care conțin o floare mixtă de bacterii și / sau ciuperci. MTM este o bază de agar de ciocolată care conține vancomicină, colistină, nistatină și lactat de trimetoprim.

       Pregătirea media

       1. Suspendă 7, 2 g bază de agar GC în 100 ml apă distilată într-un balon. Se amestecă bine, se încălzește cu agitație frecventă și se aduce la fierbere timp de 1 minut pentru a dizolva complet pulberea.
       2. Autoclavează balonul la 121 ° C timp de 15 minute.
       3. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.

       4. Se adaugă 100 ml apă distilată caldă la 2 g pulbere de hemoglobină solubilă. Amestecă pulberea cu 5-10 ml de apă distilată până când se obține o pastă netedă. Adăugați treptat echilibrul de apă până când soluția este omogenă. Amestecă continuu soluția în timpul adăugării de apă.

          În mod alternativ, se pot utiliza 100 ml soluție de hemoglobină sterilă pregătită 2%, încălzită la 50 ° C

       5. Autoclavează soluția la 121 ° C timp de 15 minute. Se răcește la 50 ° C într-o baie de apă.
       6. Reconstituie suplimentul de creștere liofilizat conținând NAD și hemin prin transferul aseptic de 10 ml de diluant însoțitor cu un ac și seringă sterile. Agitați pentru a asigura o soluție completă. După reconstituire, utilizați imediat sau depozitați la 4 ° C și utilizați în 2 săptămâni.
       7. Se adaugă aseptic 100 ml soluție de hemoglobină sterilă și supliment de creștere la 100 ml soluție de bază de agar GC. Se amestecă ușor, dar bine, pentru a evita bule de aer în agar.

       8. La soluția de bază de agar, adăugați următoarele ingrediente: 3, 0 ug / ml vancomicină

          7, 5 pg / ml colistină

          12, 5 unități / ml nistatină

          5, 0 ug / ml lactat de trimetoprim

       9. Se distribuie 20 ml în vasele Petri de 15 × 100 mm. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
       10. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

       Control de calitate

       1. Se cultivă o tulpină de N. meningitidis QC timp de 18-24 de ore pe un MTM la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
       2. Respectați MTM pentru morfologia specifică a coloniilor.
       3. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

       Rezultatul trecerii:

       • N. meningitidis ar trebui să apară pe MTM ca colonii mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, fără decolorare a mediului.
       • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   15. Agar Mueller-Hinton Agar Mueller-Hinton (MHA) este utilizat pentru realizarea mediilor necesare pentru testarea sensibilității pentru N. meningitidis, S. pneumoniae și H. influenzae. Se recomandă ca mediu de agar Mueller-Hinton deshidratat să fie achiziționat comercial, deoarece prepararea acestuia cu ingrediente individuale poate diminua calitatea.

       Pregătirea media

       1. Urmați instrucțiunile producătorului pentru a prepara MHA dintr-o bază deshidratată disponibilă în comerț.
       2. După autoclavare, răciți agarul într-o baie cu apă de 45 ° C până la 50 ° C.

       3. Turnați agar în sticlă Petri cu fund plat sau plastic Petri pe o suprafață de turnare la nivel.

          • Măsurați 60-70 ml mediu pe placă în plăci 15 × 150 mm sau măsurați 25-30 ml pe placă în plăci 15 × 100 mm pentru a obține o adâncime uniformă de aproximativ 4 mm.
          • Plăcile trebuie să aibă o grosime uniformă de 3-4 mm, deoarece rata de difuzie a agenților antimicrobieni sau activitatea medicamentelor poate fi afectată.
          • Utilizarea mai mult sau mai puțin agar va afecta rezultatele susceptibilității.
       4. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.

       5. PH-ul MHA trebuie să fie de 7, 2-7, 4.

          Nu încercați să reglați pH-ul mediului de test MHA dacă acesta se află în afara ariei

       6. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

       Control de calitate

       1. Se cultivă o tulpină de E. coli QC timp de 18-24 ore pe o placă MHA la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
       2. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

       Rezultatul trecerii:

       • Respectați creșterea E. coli.
       • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   16. Agar Mueller-Hinton cu 5% sânge de oaie sau calMar-Hinton agar cu 5% sânge de oaie sau cal este utilizat pentru testarea sensibilității pentru N. meningitidis și S. pneumoniae. Este recomandat ca mediul MHA deshidratat să fie achiziționat comercial, deoarece prepararea acestuia cu ingrediente individuale poate diminua calitatea.

       Pregătirea media

       1. Pregătiți MHA așa cum s-a descris mai sus în Secțiunea IM până la pasul 2.
       2. Se adaugă la mediu 5% sânge de oaie sau sânge defibrinat steril la 5% (adică 50 ml sânge pe litru de mediu sau 25 ml sânge la 500 ml mediu.

       3. PH-ul MHA după adăugarea sângelui trebuie să fie de 7, 2-7, 4.

          Nu încercați să reglați pH-ul dacă este în afara domeniului

       4. Turnați agar în sticlă Petri cu fund plat sau plastic Petri pe o suprafață de turnare la nivel.

          • Măsurați 60-70 ml mediu pe placă în plăci 15 × 150 mm sau măsurați 25-30 ml pe placă în plăci 15 × 100 mm pentru a obține o adâncime uniformă de aproximativ 4 mm.
          • Plăcile trebuie să aibă o grosime uniformă de 3-4 mm, deoarece rata de difuzie a agenților antimicrobieni sau activitatea medicamentelor poate fi afectată.
          • Utilizarea mai mult sau mai puțin agar va afecta rezultatele susceptibilității.
       5. Lăsați materialul să se solidifice și condensul să se usuce.
       6. Plasați plăcile în pungi de plastic sterile și depozitați la 4 ° C până la utilizare.

       Control de calitate

       1. Cultivați o tulpină de S. pneumoniae sau o tulpină de N. meningitidis QC timp de 18-24 ore pe agar Mueller-Hinton cu 5% sânge de oaie sau cal la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
       2. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).

       Rezultatul trecerii:

       • S. pneumoniae trebuie să apară ca colonii mici, de culoare gri până la gri-verde, înconjurate de un halou verde distinct (alfa-hemoliză).
       • N. meningitidis ar trebui să apară colonii mari, rotunde, netede, umede, strălucitoare și convexe, gri, cu o margine clar definită pe BAP.
       • După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână limpede.

   17. Buloth Mueller-Hinton Bulionul Mueller-Hinton este utilizat pentru prepararea bulionului Mueller-Hinton (ajustat la cation).

       Pregătirea media

       1. La 750 ml H2O deionizat se adaugă: 3, 0 g extract de vită

          17, 5 g acid hidrolizat de cazeină (acizi casamino)

          1, 5 g amidon solubil

       2. Reglați volumul final la 1 litru.
       3. Reglați pH-ul la 7.3.
       4. Autoclavează bulionul la 121 ° C timp de 20 de minute pentru a le steriliza.

       Control de calitate

       Strecurați 10 ul pe un BAP sau un CAP și incubați timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a verifica sterilitatea soluției

       Rezultatul trecerii: nu trebuie observată nicio creștere.

   18. Bulion de Mueller-Hinton (ajustat la cation) Bulionul de Mueller-Hinton (ajustat la cation) este folosit pentru a pregăti diluții standarde echivalente McFarland, cu pierderi minime de viabilitate.

       Pregătirea media

       1. Pregătiți o soluție stoc de magneziu dizolvând 8, 36 g MgCl2 · 6H2O în 100 ml H2O deionizat până la o concentrație finală de 10 ng / ml Mg2 +.
       2. Pregătiți o soluție stoc de calciu dizolvând 3, 68 g CaCl2 · 2H2O în 100 ml H2O deionizat până la o concentrație finală de 10 mg / ml Ca2 +.
       3. Filtrează-sterilizează ambele soluții stoc.
       4. La bulionul de Mueller-Hinton, adăugați soluția de stoc de magneziu la o concentrație finală de 10-12.5 mg / ml Mg2 +.
       5. Se adaugă soluția stoc de calciu la o concentrație finală de 20-25 mg / ml Ca2 +.

       Control de calitate

       Strecurați 10 ul pe un BAP sau un CAP și incubați timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a verifica sterilitatea soluției

       Rezultatul trecerii: nu trebuie observată nicio creștere.

   19. Bulionul de soia Trypticase (TSB) TSB este utilizat pentru fabricarea suspensiilor de H. influenzae înainte de testarea cerințelor de hemin și NAD. Bulb de infuzie cardiacă, soluție salină sterilă sau PBS pot fi înlocuite cu TSB.

       Pregătirea media

       1. Pregătiți volumul de TSB necesar într-un balon conform instrucțiunilor de pe eticheta mediului deshidratat.
       2. Se distribuie 5 ml în tuburi de 15 × 125 mm.
       3. Autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.
       4. Se răcește și se păstrează la 4 ° C.

       Control de calitate

       1. Cultivați o tulpină de S. pneumoniae QC timp de 18-24 ore pe un BAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
       2. H. influenzae nu crește în TSB, dar mediul nu trebuie să fie toxic pentru alte bacterii. Prin urmare, S. pneumoniae trebuie utilizat la QC pentru toxicitate.
       3. Inoculați un tub de TSB cu o buclă de creștere peste noapte de la BAP și incubați peste noapte la 35 ° C.
       4. Bulionul trebuie turbid a doua zi. Subculturați bulionul pe un BAP pentru a testa caracteristicile de creștere corespunzătoare ale S. pneumoniae.
       5. Respectați BAP pentru morfologia și hemoliza specifică a coloniilor.

       Rezultatul trecerii: coloniile S. pneumoniae sunt mici și par cenușii până la verzui-cenușiu înconjurate de un halou verde distinct (alfa-hemoliză).

2. Mijloace de depozitare și transport

   1. Sânge de oaie defibrinată Sângele de oaie defibrinat este utilizat pentru conservarea îndelungată a izolatelor prin înghețare la -70 ° C.

      Pregătirea media

      1. Agitați mecanic sângele de oaie de 30 ml cu margele de sticlă sterile sau un dispozitiv de băț din lemn într-un balon Erlenmeyer de 125-250 ml la aproximativ 90 rpm timp de 7-9 minute.

         Factorii de coagulare vor fi vizibili în balon sub forma unei pânze fibroase translucide

      2. Îndepărtați factorii de coagulare folosind forcepsuri sterile.
      3. A nu se păstra la 4 ° C când nu este folosit.

      Control de calitate

      Strecurați 10 ul pe un BAP sau un CAP și incubați timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a verifica sterilitatea soluției

      Rezultatul trecerii: nu trebuie observată nicio creștere.

   2. Mediu de transport Dorset Mediul de transport este utilizat pentru depozitarea pe termen scurt a izolatelor N. meningitidis, S. pneumoniae și H. influenzae.

      Pregătirea media

      1. Combinați soluție salină sterilă de 0, 85% cu ouă de găină întregi bătute la un raport de 1: 3.
      2. Inspizați (adică, îngroșați) amestecul într-un inspirator electric la 80 ° C timp de 60 de minute.
      3. A nu se păstra la 4 ° C când nu este folosit.

      Control de calitate

      Strecurați 10 ul pe un BAP sau un CAP și incubați timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a verifica sterilitatea soluției

      Rezultatul trecerii: nu trebuie observată nicio creștere.

   3. Soluție de grâu Soluția de creștere se folosește pentru conservarea pe termen lung a izolatelor prin congelare la -70 ° C.

      Pregătirea media

      1. La 200, 0 ml apă distilată, se adaugă: 10, 0 g albumină bovină, fracția V

         10, 0 g L-acid glutamic, sare de sodiu

         20, 0 ml glicerol

      2. Se amestecă toate ingredientele enumerate mai jos până când se dizolvă complet.
      3. Filtrați-sterilizați soluția și transferați într-un balon steril.
      4. A nu se păstra la 4 ° C când nu este folosit.

      Control de calitate

      Strecurați 10 ul pe un BAP sau un CAP și incubați timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a verifica sterilitatea soluției

      Rezultatul trecerii: nu trebuie observată nicio creștere.

   4. Mediu trans-izolat modificat (MT-I) Mediu trans-izolat modificat (MT-I) a fost proiectat și dezvoltat pentru a fi un mediu simplu și ieftin pentru transportul LCR și pentru creșterea meningococilor în epidemii de scară largă a bolii meningococice. Este mai puțin costisitor și mai ușor de produs decât TI-ul standard și poate fi produs în majoritatea laboratoarelor de microbiologie la aproximativ 0, 50 USD / sticlă, oferind un mediu relativ ieftin, disponibil rapid (reducând timpul de producție și costuri de transport și mijloace de transport) și instrument de diagnostic. pentru utilizare în timpul unei epidemii de meningită. Ingredientele formulării MT-I sunt similare cu cele din TI, cu modificări pentru a elimina ingredientele costisitoare și a economisi timp.

      Evaluarea de laborator a demonstrat că creșterea / supraviețuirea izolatelor de meningococ a fost egală în TI și MT-I în mai multe condiții de mediu. Nu a fost încă evaluată în condiții de teren cu probe clinice. Nu suportă creșterea H. influenzae; prin urmare, nu este utilizat pentru supravegherea de rutină a agenților meningitei bacteriene.

      Trebuie utilizate flacoane cu șurub cu sticlă rotundă sterilă și rotundă (cu căptușeală de cauciuc) de 0, 5 oz.

      Sticlele MT-I trebuie depozitate în poziție verticală la 4 ° C atunci când nu sunt utilizate imediat și încălzite la temperatura camerei (25-30 ° C) înainte de utilizare. În frigider, faza lichidă devine gelatinoasă, dar se lichefiază la temperatura camerei. Mass-media MT-I are un termen de valabilitate de 1 an cu o stocare corespunzătoare.

      Pregătirea media

      1. Se cântăresc toate ingredientele enumerate mai jos și se introduc într-un balon Erlenmeyer de 500 ml.8 g gelatină 2.0%

         2 g 0, 5% agar

         2, 5 g Tris-HCl

         0, 5 g Tris bază

         12 g 3, 0% bulion de soia triptic

      2. Se adaugă 350 ml de apă distilată, deionizată în balon (pH-ul trebuie să fie de 7, 5 la 25 ° C).
      3. Puneți o bară de agitare magnetică în balon și așezați balonul pe agitatorul cu plăci fierbinți.
      4. Aduceți soluția la fierbere (90-100 ° C) pentru a se topi și dizolva gelatina până când mediul este complet limpede (aproximativ 30-45 minute).
      5. Scoateți balonul din agitatorul pentru plăci fierbinți.
      6. Se amestecă 2, 6 g amidon 0, 5% solubil cu o cantitate mică de apă rece și se dizolvă complet.
      7. După ce amidonul este distribuit uniform pe mediu, adăugați 1, 6 g 0, 4% cărbune activat și reglați apa la 400 ml.

      8. Întoarceți balonul în agitatorul pentru plăci fierbinți până când toate ingredientele sunt bine amestecate (aproximativ 10 minute).

         Soluția ar trebui să fie lichidă, să aibă o culoare neagră și nu trebuie să prezinte aglomerații

      9. Coborâți căldura la un nivel scăzut, astfel încât vasul să poată fi manipulat confortabil în timp ce distribuiți mediul.

         Opțional: La această etapă, procedura poate fi oprită peste noapte dacă nu există suficient timp pentru a distribui. Împărțiți materialul în două baloane și așezați ambele flacoane la 4 ° C peste noapte. A doua zi, aplicați căldură până când s-a topit complet și alicot (vezi pasul 10)

      10. În timp ce se agită mediul, se folosește o pipetă serologică sterilă pentru a îndepărta 7 ml de mediu și se distribuie în fiecare flacon.
      11. Înveliți fiecare flacon cu un capac cu șurub.
      12. Autoclavează sticlele timp de 15 minute la 121 ° C.
      13. Strângeți capacele cât mai curând posibil după autoclavare.
      14. Rotiți sticlele pentru a evita așezarea cărbunelui.

      15. Înclinați sticlele peste noapte (sau cel puțin 4 ore) pe un baston înclinat din lemn (35 mm, 35 mm, 500 mm).

          Când este înclinat, lichidul trebuie să ajungă pe umărul sticlei

      16. După ce mediul este ferm, stați sticlele în poziție verticală.
      17. În aproximativ 1 oră, slantul slab ar trebui să elibereze o parte din bulion, iar mediul trebuie să apară bifazic.
      18. A nu se păstra la 4 ° C când nu este folosit.

      Control de calitate

      1. Creste tulpinile N. meningitidis și S. pneumoniae QC timp de 18-24 ore pe un BAP sau un CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Pentru fiecare organism, faceți o suspensie de celule echivalentă cu un standard 0, 5 McFarland (~ echivalent cu 1, 5 × 108 CFU / ml) și diluați-o în serie pentru a obține o dimensiune a inoculului de 103 CFU / ml în bulion de infuzie cardiacă creieră (BHI).
      3. Scoateți capacul șurubului din 3 sticle MT-I.

      4. Inoculați sticlele MT-I cu 100 ui din suspensiile de 103 CFU / ml în 15 minute de la preparare (dimensiunea inoculului este de 100 CFU) și înlocuiți bine capacele șuruburilor.

         După inoculare și înlocuirea capacelor șuruburilor, inversați fiecare sticlă MT-I de mai multe ori pentru a amesteca

      5. Desfaceți ușor capacele șuruburilor din sticlele MT-I pentru a permite un schimb de aer.
      6. Incubați sticlele MT-I timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      7. Închideți bine capacele șuruburilor și inversați fiecare sticlă MT-I de mai multe ori pentru a se amesteca.
      8. Îndepărtați 10 pl de bulion din fiecare sticlă MT-I și inoculați un BAP pentru MT-Is conținând N. meningitidis și S. pneumoniae și un CAP pentru MT-I care conține H. influenzae.
      9. Strecurați pentru izolare cu o buclă sterilă și plăci de incubat timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a detecta creșterea tulpinilor de QC.

      Rezultatele trecerii:

      • N. meningitidis ar trebui să apară colonii mari, rotunde, netede, umede, strălucitoare și convexe, gri, cu o margine clar definită pe BAP.
      • S. pneumoniae ar trebui să apară ca colonii mici, de culoare gri până la gri-verde, înconjurate de un halou verde distinct (alfa-hemoliză) pe BAP.

   5. 10% lapte degresat și 15% soluție glicerol10% lapte degresat și 15% soluție glicerolă se utilizează pentru conservarea îndelungată a izolatelor prin înghețare la -70 ° C.

      Pregătirea media

      1. Se pun 10 g lapte degresat deshidratat și 85 ml apă distilată în balon A. Se amestecă.
      2. Puneți 15 ml de glicerol în balonul B.
      3. Autoclavează ambele baloane la 115 ° C timp de 10 minute și evacuează cu atenție presiunea.
      4. În timp ce este încă fierbinte, turnați conținutul balonului A în balonul B într-un dulap de siguranță.
      5. A nu se păstra la 4 ° C când nu este folosit.

      Control de calitate

      Strecurați 10 ul pe un BAP sau un CAP și incubați timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a verifica sterilitatea soluției

      Rezultatul trecerii: nu trebuie observată nicio creștere.

   6. MediuSTGG cu lapte degresat cu glucoză glucoză (STGG) este utilizat pentru transportul și depozitarea pe termen scurt a tampoanelor nazofaringiene.

      Pregătirea media

      1. Adăugați următoarele ingrediente la 100 ml apă distilată: 2 g lapte praf degresat

         3 g TSB

         0, 5 g glucoză

         10 ml glicerol

      2. Se amestecă pentru a dizolva complet toate ingredientele.
      3. Se distribuie cantități de 1, 0 ml în flacoane cu capac cu șurub de 1, 5 ml.
      4. Slăbiți capacele șuruburilor și autoclava la 121 ° C timp de 10 minute.
      5. Strângeți capacele după fixarea automată și depozitați la -20 ° C până la utilizare.

      Control de calitate

      Strecurați 10 ul pe un BAP sau un CAP și incubați timp de 48 de ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a verifica sterilitatea soluției

      Rezultatul trecerii: nu trebuie observată nicio creștere.

   7. Trans-izolate (TI) mediumT-I este utilizat pentru a transporta LCR și a crește N. meningitidis, H. influenzae și S. pneumoniae din LCR. Trebuie utilizate flacoane de tuburi de 10 cmc cu dopuri de cauciuc și capace de etanșare pentru sertizare din aluminiu. Sticlele TI trebuie depozitate în poziție verticală la 4 ° C atunci când nu sunt utilizate imediat. Mediile TI trebuie încălzite la temperatura camerei (25 ° C) înainte de utilizare. În frigider, faza lichidă devine gelatinoasă, dar se lichefiază la temperatura camerei. Media TI are o durată de valabilitate de 1 an cu o stocare adecvată.

      Pregătirea media

      Diluant pentru faze solide și lichide: 3- tampon de acid propanesulfonic (N-morfolino) propanesulfonic (MOPS); 0, 1 M, pH 7, 2

      1. Se dizolvă 20, 93 g MOPS în 900 ml apă distilată.
      2. Ajustați la pH 7, 2 cu NaOH 1N.
      3. Reglați volumul la 1000 ml cu apă distilată.

      Faza solidă

      Cărbune activat - 2, 0 g

      Amidon solubil - 2, 5 g

      Agar - 10, 0 g

      1. Se suspendă cărbunele activat, amidonul solubil și agarul în 500 ml de tampon MOPS într-un balon și se adaugă o bară magnetică în balon.
      2. Se încălzește pe o placă fierbinte cu agitator magnetic pentru a dizolva cărbunele și amidonul și topi agarul.
      3. În timp ce agitați pentru a menține cărbunele în suspensie, utilizați o pipetă serologică sterilă pentru a îndepărta 5, 0 ml și distribuiți în fiecare sticlă de ser.
      4. Înveliți fiecare sticlă cu o bucată de folie de aluminiu și autoclave la 121 ° C timp de 20 de minute.
      5. Scoateți din autoclav și înclinați sticlele până când ajung la temperatura camerei (25 ° C), astfel încât vârful agarului să ajungă la umărul fiecărei sticle.

      Faza lichidă

      Bulion de soia triptic (TSB) - 30, 0 g

      Gelatină - 10, 0 g

      Tampon MOPS - 500, 0 ml

      1. Încălziți TSB, gelatină și tampon MOPS pentru a dizolva complet gelatina și a evita coagularea.
      2. Autoclavează mediul la 121 ° C timp de 15 minute.

      Aditiv opțional pentru creșterea H. influenzae

      1. După ce mediul de fază lichidă în vrac s-a răcit la temperatura camerei (25 ° C) după autoclavare, adăugați 10 ml de supliment suplimentar de creștere a lichidului steril care conține NAD și hemin aseptic pentru a ajuta la susținerea creșterii H. influenzae.

         • Alternativ, adăugați aseptic 0, 1 ml de supliment într-o sticlă de TI individuală (1% din volumul ambelor faze) sau la un număr limitat de sticle, după cum este necesar.
         • Dacă se utilizează un supliment comercial de creștere (metodă preferată), acesta trebuie să fie un produs steril și poate fi adăugat direct la mediul TI.

         • Dacă suplimentul de creștere este preparat în laborator, acesta trebuie sterilizat cu filtru înainte de a fi adăugat la mediu TI. Pentru a pregăti suplimentul în laborator:

           • Se dizolvă suplimentul liofilizat într-un diluant adecvat (de obicei apă).
           • Filtrează-sterilizează folosind o membrană de dimensiunea porilor de 0, 45 microni.
           • Folosiți imediat.

      Mediu TI

      1. Aruncați 5 ml din faza lichidă aseptic în fiecare dintre sticlele care conțin oblicii în faza solidă.
      2. Sigilați sticlele cu dopuri de cauciuc sterile și capace de aluminiu. Utilizați un instrument de sertizare manuală pentru a fixa capacele din aluminiu dacă nu este disponibil un sistem automat.
      3. A nu se păstra la 4 ° C când nu este folosit.

      Control de calitate

      1. Cresc tulpini de N. meningitidis, S. pneumoniae și H. influenzae QC timp de 18-24 ore pe un BAP sau CAP la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      2. Pentru fiecare organism, faceți o suspensie celulară echivalentă cu un standard de 0, 5 McFarland (~ echivalent cu 1, 5X108 CFU / ml) și diluați serial pentru a obține o dimensiune a inoculului de 103 CFU / ml în bulion de infuzie cardiacă cerebrală (BHI).

      3. Folosind forcepsuri sterile, trageți capacul de aluminiu de 3 sticle TI departe de dopul de cauciuc și ștergeți dopul cu 70% izopropanol sau etanol.

         Nu folosiți povidon-iod

      4. Utilizați o seringă sterilă și un ac pentru a inocula sticlele de TI cu 100 ul de suspensii de 103 CFU / ml în 15 minute de la preparare (dimensiunea inoculului este de 100 CFU).

         Utilizați un ac și o seringă nouă pentru fiecare TI. După inoculare și îndepărtarea seringii și acului din dopul de cauciuc, inversați fiecare sticlă de TI de mai multe ori pentru a amesteca

      5. Introduceți un ac de aerisire TI sterilizat în dopul de cauciuc al fiecăreia din sticlele TI inoculate.

         Asigurați-vă că acele de evacuare nu ating bulionul

      6. Se incubează flacoanele TI evacuate timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări).
      7. Îndepărtați și aruncați ace de evacuare. Invertiți fiecare sticlă de mai multe ori pentru a amesteca.
      8. Folosiți o seringă și un ac steril pentru a îndepărta 100-200 pl de bulion din fiecare sticlă de TI și puneți bulionul într-un tub de microcentrifugă steril, marcat cu 1, 5 ml. Inoculați un BAP pentru T-Is conțin N. meningitidis și S. pneumoniae și un CAP pentru TI care conține H. influenzae cu 10 ui din acest bulion.
      9. Fixați pentru colonii izolate cu o buclă sterilă și plăci de incubat timp de 18-24 ore la 35-37 ° C cu ~ 5% CO ₂ (sau într-un borcan de lumânări) pentru a detecta creșterea tulpinilor de QC.

      Rezultatele trecerii:

      • N. meningitidis ar trebui să apară ca colonii mari, rotunde, netede, umede, strălucitoare și convexe, gri, cu o margine clar definită pe BAP.
      • S. pneumoniae ar trebui să apară ca colonii mici, de culoare gri până la gri-verde, înconjurate de un halou verde distinct (alfa-hemoliză) pe BAP.
      • H. influenzae trebuie să pară coloniile opace mari, rotunde, netede, convexe, incolore până la gri, fără decolorarea mediului.

3. Reactivi diferiți

   1. Reactivi de pată Gram

      Violet de cristal oxalat de amoniu

      1. Se dizolvă 2, 0 g violet cristal certificat în 20, 0 ml alcool etilic 95%.
      2. Se dizolvă 0, 8 g oxalat de amoniu în 80, 0 ml apă distilată.
      3. Amestecă cele două soluții împreună și lasă-le să stea peste noapte la temperatura camerei (25 ° C).
      4. Filtrați prin hârtie cu filtru grosier înainte de utilizare.
      5. A se păstra la temperatura camerei (25 ° C).

      Iodul Gram (protejează soluția de lumină)

      1. Se macină 1, 0 g iod (cristalin) și 2, 0 g iodură de potasiu într-un mortar. Adăugări mici de apă distilată pot fi de ajutor în pregătirea soluției.
      2. Se adaugă la 300, 0 ml apă distilată.
      3. Păstrați la temperatura camerei (25 ° C) într-o sticlă acoperită cu folie.

      Decolorizatorul este alcool etilic 95%

      Recipient (există 2 opțiuni: safranin sau carbol-fuchin)

      Safraninul

      1. Se adaugă 2, 5 g de safranină-O certificată la 100, 0 ml alcool etilic 95%.
      2. Se adaugă 10, 0 ml soluție de safranină și alcool etilic obținute la pasul 1 la 90, 0 ml apă distilată.
      3. A se păstra la temperatura camerei (25 ° C).

      Ziehl-Nielsen carbol-fuchsin (poate fi un contrasens mai eficient decât safranina)

      1. Se dizolvă 0, 3 g fucsină bazică în 10, 0 ml alcool etilic 95%.
      2. Se adaugă 5, 0 ml cristale fenol topite la 95, 0 ml apă distilată.
      3. Se adaugă soluția de fenol 5% în soluția de fuchsin și se lasă să stea peste noapte.
      4. Se filtrează prin hârtie cu filtru grosier.
      5. Păstrați la temperatura camerei (25 ° C) într-o sticlă acoperită cu folie până la 1 an.

   2. Tinctura de iod Tinctura de iod este utilizată ca antiseptic pentru piele și nu trebuie utilizată pentru a dezinfecta dopurile de cauciuc ale sticlelor de TI și a culturii de sânge.

      1. Se adaugă 1 g de iod la 100 ml alcool izopropilic 70%.
      2. Păstrați la temperatura camerei (25 ° C) într-o sticlă acoperită cu folie până la 1 an.

   3. Standarde de turbiditate McFarland

      1. Pregătiți o soluție de 1% de BaCl2 anhidru (clorură de bariu).
      2. Pregătiți o soluție 1% de H2SO4 (acid sulfuric).
      3. Combinați și amestecați complet soluțiile de clorură de bariu și acid sulfuric pentru a forma o suspensie turbidă de BaSO4 într-o proporție specifică pentru fiecare standard de turbiditate McFarland, așa cum se arată în tabelul 1.
      4. Puneți amestecul rezultat într-un tub cu capac cu șurub acoperit cu folie.
      5. Depozitați standardul McFarland la temperatura camerei (25 ° C) atunci când nu folosiți. Pregătiți o soluție standard proaspătă la fiecare 6 luni. Soluția de densitate standard McFarland va precipita și se va aglomera în timp și are nevoie de vârtej puternic înainte de fiecare utilizare. Marcați tubul pentru a indica nivelul de lichid și verificați înainte de utilizare pentru a vă asigura că nu s-a produs evaporarea.

      Tabelul 1. Standarde de turbiditate McFarland

      Tabelul 1. Standarde de turbiditate McFarland

      Standardul de turbiditate McFarland nr.	0.5	1	2	3	4
      1% clorură de bariu (ml)	0, 05	0.1	0.2	0.3	0.4
      1% acid sulfuric (ml)	9, 95	9.9	9.8	9.7	9.6
      Aproximativ. densitatea celulei (1 × 10 ^ 8 CFU / ml)	1.5	3.0	6	9	12, 0

   4. Soluție salină tamponată cu fosfat (PBS)

      1. La 1000 ml apă distilată, se adaugă următoarele ingrediente pentru 0, 1 M PBS:

         • 7 g fosfat de dihidrogen de sodiu
         • 7 g fosfat de hidrogen disodic
      2. Se amestecă pentru a dizolva complet ingredientele.
      3. Reglați pH-ul la 7, 2 cu 1 N acid sau bază.
      4. Distribuiti tamponul într-un balon și autoclave la 121 ° C timp de 15 minute.
      5. A se păstra la temperatura camerei (25 ° C) până la un an.

   5. Ser fiziologic

      1. Se dizolvă 8, 5 g NaCl în 1 L apă distilată.
      2. Se autoclavează la 121 ° C timp de 15 minute sau se sterilizează cu filtrare cu membrană.
      3. A se păstra la temperatura camerei (25 ° C) până la 6 luni.

Începutul paginii